中藥復(fù)方多糖對(duì)不同MHC B-LβⅡ基因型雞淋巴細(xì)胞IL-1β、IL-8和TNF-α mRNA表達(dá)量的影響

馬 昭，羅 燕，劉 鋼，楊 莉，劉曉婷，朱曉慶，谷新利

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003)

從20世紀(jì)30年代人們發(fā)現(xiàn)多糖的抗腫瘤活性后，科研工作者對(duì)中藥多糖產(chǎn)生了濃厚的興趣，發(fā)現(xiàn)了多種具有生物活性的中藥多糖。免疫調(diào)節(jié)作用是中藥多糖的生物活性之一，大量的藥理試驗(yàn)也證實(shí)中藥多糖能通過(guò)激活淋巴細(xì)胞，使淋巴細(xì)胞處于活化狀態(tài)，誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)、功能和表型發(fā)生變化，分泌細(xì)胞因子等方式增強(qiáng)機(jī)體免疫力。并且，中藥多糖具有療效持久，毒性和不良反應(yīng)少等諸多優(yōu)點(diǎn)[1]。

主要組織相容性復(fù)合體(majior histocompatibility complex，MHC)是與免疫應(yīng)答和抗病性密切相關(guān)的一組基因群，它編碼細(xì)胞表面的特異性蛋白。MHC作為細(xì)胞表面的糖蛋白，在細(xì)胞免疫和體液免疫中發(fā)揮著重要作用。MHC抗原基因具有高度的多態(tài)性，不僅決定了所表達(dá)抗原分子的多態(tài)性，而且決定了生物學(xué)功能的多樣性。由于MHC基因的多態(tài)性導(dǎo)致不同個(gè)體間對(duì)疾病抗性和易感性存在差異[2-3]。王世波等[4]研究了魯禽雞、瑯琊雞和石歧雞B-F exon2的多態(tài)性以及SNP位點(diǎn)與綿羊紅細(xì)胞(SRBC)免疫抗體滴度和新城疫(ND)及禽流感(AI)的免疫抗體滴度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)AI、ND以及SRBC抗原抗體的產(chǎn)生與B-F exon2的多態(tài)性有較強(qiáng)的相關(guān)性。周偉等[5]研究了狼山雞MHC多態(tài)性及血型與部分抗性性狀相關(guān)性，結(jié)果提示免疫性狀和血型之間有關(guān)聯(lián)性。

基于以上研究基礎(chǔ)，本試驗(yàn)采用PCR-SSCP和實(shí)時(shí)熒光定量PCR real-time PCR方法，檢測(cè)中藥復(fù)方多糖(compound Chinese herbal medicinal polysaccharides，cCHMPS)對(duì)不同MHC B-Lβ Ⅱ基因型雞淋巴細(xì)胞中IL-1β、TNF-α和IL-8 mRNA表達(dá)量的影響，探討MHC B-Lβ Ⅱ基因多態(tài)性對(duì)中藥復(fù)方多糖提高雞淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的最佳使用劑量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物 中藥復(fù)方多糖由黨參、山楂、熟地、何首烏、當(dāng)歸、茯苓、補(bǔ)骨脂等11味中藥組成，各單味藥均購(gòu)自石河子市醫(yī)藥公司；中藥復(fù)方多糖粗提取物是從中藥復(fù)方中采用水提-醇沉法提取，再經(jīng)AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附解吸附后獲得精制的中藥復(fù)方多糖，即cCHMPS，其含糖量為77.10%；用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將其配置成200、150、100 μg/mL的cCHMPS，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)后4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑與儀器 雞外周血淋巴細(xì)胞分離液，天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；RPMI 1640培養(yǎng)基，PBS磷酸緩沖液，胎牛血清，SYBR Green熒光染料，real-time PCR試劑，全式金公司產(chǎn)品；DEPC，上海生物工程公司產(chǎn)品；雞新城疫疫苗(La Sota株)，普萊柯生物工程股份有限公司產(chǎn)品；RNA、DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒，RNAprep Pure Cell/Bacteria k-it，北京田根生物工程公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)，垂直離心機(jī)，新疆農(nóng)墾科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 500羽1日齡京紅1號(hào)蛋雞，購(gòu)自新疆昌吉某孵化場(chǎng)。翅下靜脈采血0.2 mL/羽，置于肝素鈉抗凝采血管中搖勻，置-20℃冷凍保存。按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取雞全血DNA，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中收錄的雞MHC B-LβⅡ基因序列(№M29763.1)，應(yīng)用Oligo軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為：上游引物：5′-AAACCGACCGTCTGGCGTGCTA-3′，下游引物：5′-TTACCCCACGCCTGGCTGAT-3′，擴(kuò)增片段238 bp，引物由華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系為20 μL：10 μL 的2×RCRMix，2 μL模板DNA，上、下游引物各0.5 μL，7 μL ddH2O，總體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；94℃ 40 s，60.5℃ 45 s，72℃ 35 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃結(jié)束反應(yīng)。取5 mL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察并拍照。

1.2.4 淋巴細(xì)胞的分離與成活率檢測(cè) 根據(jù)PCR-SSCP基因型對(duì)雞分組，參照文獻(xiàn)[6]靜脈采血提取淋巴細(xì)胞，胎盤(pán)藍(lán)染色，顯微鏡下數(shù)死細(xì)胞和活細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算活細(xì)胞成活率。

1.2.5 試驗(yàn)分組與細(xì)胞培養(yǎng) 將分離得到的淋巴細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106個(gè)/mL。將雞淋巴細(xì)胞按不同基因型分組，每組設(shè)置3個(gè)劑量組，調(diào)整cCHMPS的終濃度分別為100、75、50、0 μg/mL，接于6孔培養(yǎng)板中，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

1.2.6 雞淋巴細(xì)胞總RNA提取 收集淋巴細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取淋巴細(xì)胞的總RNA。RNA純度檢測(cè)：檢測(cè)其OD260nm/OD280nm比值，其比值在1.8～2.0之間。

1.2.7 RNA反轉(zhuǎn)錄 將2 μL 5×gDNA Graser buffer、1 μL gDNA eraser、5 μL RNase free water、2 μL RNA模板混勻，42℃反應(yīng)2 min，迅速冰浴，即反應(yīng)液Ⅰ，最后將1 μL Prime Scriptrt MIXⅠ、1 μL RT Primer MIX、4 μL 5×Primscript buffer、4 μL RNase free water加入反應(yīng)液Ⅰ中，37℃反應(yīng)15 min，85℃加熱5 s使反轉(zhuǎn)錄酶失活，取出EP管，置-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 cDNA的PCR反應(yīng)體系與程序 根據(jù)GenBank公布的IL-1β、TNF-α、IL-8及β-Actin基因mRNA的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)RCR特異性引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 目的基因引物序列及PCR條件

cDNA的PCR反應(yīng)體系：1 μL cDNA模板，上游引物和下游引物各0.5 μL，8 μL ddH2O，10 μL的2×RCRMix， 總體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，退火30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃結(jié)束反應(yīng)。

1.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR real-time PCR反應(yīng)體系：2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMIX 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，1 μL cDNA，8 μL ddH2O，20 μL體系。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 30 s；94℃ 5 s；退火15 s，72℃ 10 s，共42個(gè)循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 MHC B-LβⅡ基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

用所設(shè)計(jì)的引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，取所得PCR產(chǎn)物5 μL于瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(圖1)。所設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增結(jié)果較好，片段長(zhǎng)度與預(yù)期大小一致，條帶清晰，無(wú)非特異性條帶，可直接進(jìn)行SSCP分析。

1.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000； 2～11.MHC B-LβⅡ基因1.DNA Maker DL 1 000；2-11.MHC B-LβⅡ gene

2.2 PCR-SSCP分析

對(duì)所有DNA樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所擴(kuò)增片段有3種基因型，分別定義為AA(103羽)、BB(266羽)和BC(131羽)(圖2)。

1、6、8、10、12.BC基因型；3、5.AA基因型；2、4、7、9、11、13.BB基因型

1，6，8，10，12.BC genotype; 3，5.AA genotype; 2，4，7，9，11，13.BB genotype

圖2部分雞MHC B-Lβ Ⅱ基因PCR-SSCP電泳圖譜

Fig.2 Electrophoretic patterns of PCR-SSCP products of MHC B-LβⅡ gene

2.3 IL-1β、TNF-α、IL-8及β-Actin擴(kuò)增結(jié)果

用所設(shè)計(jì)的雞IL-1β、TNF-α、IL-8及β-Actin基因的引物，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng) 20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別獲得了145 bp、80 bp、229 bp的目的條帶(圖3)。

1.IL-1β基因; 2.IL-8基因; 3.TNF-α基因; 4.基因β-Actin; 5.DNA 標(biāo)準(zhǔn)

1.IL-1β gene; 2.IL-8 gene;3.TNF-α gene; 4.β-Actin gene; 5.DNA Maker

圖3 IL-1β、TNF-α、IL-8及β-Actin基因PCR產(chǎn)物電泳圖

Fig.3 Electrophoretic patterns of PCR products of IL-1β,TNF-α,IL-8 and β-Actin genes

2.4 中藥復(fù)方多糖對(duì)不同MHC B-LβⅡ基因型雞外周血淋巴細(xì)胞中IL-1β mRNA表達(dá)量的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，cCHMPS能顯著促進(jìn)雞淋巴細(xì)胞IL-1β mRNA的表達(dá)，且在不同基因型雞中，最有效的提高IL-1β mRNA表達(dá)量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，cCHMPS劑量為75 μg/mL和50 μg/mL時(shí)，雞淋巴細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)量顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，cCHMPS劑量為100 μg/mL時(shí)，雞淋巴細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，cCHMPS劑量為50 μg/mL時(shí)，IL-1β mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。

2.5 中藥復(fù)方多糖對(duì)不同MHC B-LβⅡ基因型雞外周血淋巴細(xì)胞中TNF-α mRNA表達(dá)量的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，cCHMPS能顯著促進(jìn)雞淋巴細(xì)胞TNF-α mRNA的表達(dá)，且在不同基因型雞中，最有效的提高TNF-α mRNA表達(dá)量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，cCHMPS劑量為75μg/mL和50 μg/mL時(shí)，雞淋巴細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)量顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，cCHMPS劑量為100 μg/mL時(shí)雞淋巴細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，cCHMPS劑量為50 μg/mL時(shí)，TNF-α mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。

2.6 中藥復(fù)方多糖對(duì)不同MHC B-LβⅡ基因型雞外周血淋巴細(xì)胞中IL-8 mRNA表達(dá)量的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，cCHMPS能顯著促進(jìn)雞淋巴細(xì)胞IL-8 mRNA的表達(dá)，且在不同基因型雞中，最有效的提高IL-8 mRNA表達(dá)量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，cCHMPS劑量為75μg/mL和50 μg/mL時(shí)，雞淋巴細(xì)胞IL-8 mRNA表達(dá)量顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，cCHMPS劑量為100 μg/mL時(shí)雞淋巴細(xì)胞IL-8 mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，cCHMPS劑量為50 μg/mL時(shí)，IL-8 mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。

表2 中藥復(fù)方多糖對(duì)各基因型雞淋巴細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)量的影響

注：同行小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)，*表示與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。

Note:In the same row,different letters mean significant difference(P<0.05).*means significant difference compared with control group.

表3 中藥復(fù)方多糖對(duì)各基因型雞淋巴細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)量的影響

注：同行小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)，*表示與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。

Note:In the same row,different letters mean significant difference(P<0.05).*means significant difference compared with control group.

表4 中藥復(fù)方多糖對(duì)各基因型雞淋巴細(xì)胞IL-8 mRNA表達(dá)量的影響

注：同行小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)，*表示與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。

Note:In the same row,different letters mean significant difference(P<0.05).*means significant difference compared with control group.

3 討論

3.1 中藥復(fù)方多糖對(duì)雞淋巴細(xì)胞IL-1β、TNF-α、IL-8 mRNA表達(dá)量的影響

淋巴細(xì)胞是參與機(jī)體免疫應(yīng)答的主要免疫效應(yīng)細(xì)胞[7]。淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子是一類(lèi)具有免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)，是免疫系統(tǒng)重要的免疫信號(hào)分子[8]。研究細(xì)胞因子有助于了解機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。IL-1β、TNF-α、IL-8等炎癥細(xì)胞因子在免疫應(yīng)答中充當(dāng)著十分重要的角色。其中，IL-1β是IL-1的主要亞型之一，具有高度生物活性，可以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的增殖分化，刺激抗體產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫作用等[9]，也能刺激產(chǎn)生IL-8、中性粒細(xì)胞活化劑等多種趨化因子，以及誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放IL-6、TNF[10]。IL-8是一種趨化性細(xì)胞因子，由Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，使趨化細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，激活炎性細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，釋放炎性介質(zhì)，具有抗炎的作用[11]。TNF-α是由Th1細(xì)胞分泌，它作為活化的單核細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子在炎癥和感染機(jī)制中起著介導(dǎo)作用[12]。TNF-α可殺傷腫瘤細(xì)胞，激活中性粒細(xì)胞，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的分化和增殖，同時(shí)可促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌的IL-1β及TNF-α等細(xì)胞因子[13]。

許多研究表明，中藥多糖對(duì)機(jī)體的細(xì)胞因子都具有調(diào)節(jié)作用。趙天章等[14]研究了黃芪多糖(APS)對(duì)肉仔雞血清免疫細(xì)胞因子含量的影響，發(fā)現(xiàn)APS可提高肉仔雞血清IL-1、IL-2、TNF-α的含量。伊瑞卿等[15]研究了枸杞多糖對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能和免疫功能的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示枸杞多糖能提高雞淋巴細(xì)胞IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)量。孟俊龍等[16]研究表明，姬松茸多糖可提高大鼠脾臟IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)。李馨等[17]研究表明，北冬蟲(chóng)夏草多糖可以增加脾臟IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)量，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。江澤波等[18]研究表明，豬苓多糖可通過(guò)TLR4信號(hào)通路活化M1巨噬細(xì)胞，上調(diào)IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量，從而起到增強(qiáng)機(jī)體免疫力的效應(yīng)。本研究表明，中藥復(fù)方多糖能提高IL-1β、TNF-α、IL-8 mRNA的表達(dá)量，提示中藥多糖可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體的抗感染能力。當(dāng)然，中藥多糖雖然能促進(jìn)機(jī)體IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)，但是并非越高越好，三者之間必須處于一定的平衡狀態(tài)，才能維持機(jī)體正常的生命活動(dòng)，否則會(huì)發(fā)生自身免疫疾病等嚴(yán)重癥狀。

3.2 雞MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性對(duì)cCHMPS促進(jìn)淋巴細(xì)胞IL-1β、TNF-α、IL-8 mRNA表達(dá)量的劑量影響

雞MHC基因家族在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著極其重要和十分廣泛的生物學(xué)功能，同時(shí)雞MHC抗原在體液免疫和細(xì)胞免疫中均有重要作用。雞MHC抗原在體液免疫和細(xì)胞免疫發(fā)揮著很重要的作用。每個(gè)個(gè)體細(xì)胞表面的MHC抗原都具有特異性，是自身識(shí)別的標(biāo)志，能強(qiáng)烈排斥外來(lái)異物。T細(xì)胞表面有抗原結(jié)合的受體，簡(jiǎn)稱(chēng)TCR(T cell receptor)。TCR具有特異性，只與特定的抗原結(jié)合， TCR只識(shí)別結(jié)合在自身MHC分子上的抗原。大多數(shù)T細(xì)胞含有CD4和CD8膜分子，表達(dá)的CD4 T細(xì)胞只識(shí)別MHC Ⅱ類(lèi)分子遞呈的抗原。CD4 T細(xì)胞做為輔助性T細(xì)胞(Th)，通過(guò)識(shí)別抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)MHCⅡ類(lèi)分子遞呈的抗原而被活化，活化后的Th細(xì)胞分裂增殖，同時(shí)分泌各種細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。此外，T細(xì)胞在識(shí)別外來(lái)抗原同時(shí)，還要識(shí)別MHC分子，說(shuō)明T細(xì)胞受體在識(shí)別抗原時(shí)需要依賴(lài)抗原遞呈的MHC分子[3]。

雞MHC B-Lβ Ⅱ基因具有豐富的多態(tài)性和功能特異性，是人們研究抗病基因的主要候選基因之一。李福偉等[19]研究表明個(gè)體以及品種之間存在不同免疫能力的遺傳差異，并且不同的免疫性狀存在顯著的優(yōu)勢(shì)基因型。李尚民[20]等的研究表明雞MHC B-Lβ Ⅱ基因外顯子2的遺傳變異對(duì)京海黃雞抗病能力影響顯著，可作為球蟲(chóng)抗病能力選育候選基因。劉立波[21]等研究了雞MHC B-L基因SNPs單倍體型與血清中IgG含量、LPS含量、禽流感(AI)抗體滴度等免疫性狀關(guān)系，結(jié)果表明不同免疫性狀存在顯著相關(guān)的優(yōu)勢(shì)SNPs單倍型。楊紅洋等[22]研究了中藥復(fù)方多糖對(duì)不同MHC B-Lβ Ⅱ基因型雞血清細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的影響，發(fā)現(xiàn)MHC B-Lβ Ⅱ基因多態(tài)性使雞血清細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度產(chǎn)生差異。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在同一劑量的cCHMPS中，不同MHC B-L β Ⅱ基因型雞，其淋巴細(xì)胞中IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)量差異顯著，此研究結(jié)果與李福偉、李尚民、劉立波、楊紅洋等人的究結(jié)果相一致，說(shuō)明不同免疫能力存在個(gè)體水平上的差異，并且在不同基因型雞中，最有效的提高雞淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的cCHMPS劑量略有不同。

從本試驗(yàn)得出中藥復(fù)方多糖可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌來(lái)提高機(jī)體免疫力且其生物活性有一定的劑量范圍，同時(shí)MHC B-Lβ Ⅱ基因多態(tài)性使不同個(gè)體雞的免疫能力產(chǎn)生差異。

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