4株利奈唑胺不敏感糞腸球菌的23S rRNA基因突變分析

林 賀， 薛 苗， 汪懷周， 黃曉春， 秦陽華

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院檢驗科，上海 201801；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院實驗診斷科，上海 200433）

利奈唑胺是一種人工合成的噁唑烷酮類抗菌藥物，通過與細(xì)菌核糖體50S亞基結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄的初始步驟起作用，對革蘭陽性菌，包括耐青霉素的肺炎鏈球菌（penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae，PRSP）、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）和耐萬古霉素的腸球菌（vancomycin-resistant Enterococcus，VRE）都具有良好的抗菌作用。2000年利奈唑胺在美國首先上市，2007年開始在我國臨床使用，對于治療相關(guān)病原菌引起的感染發(fā)揮了巨大的作用。隨著利奈唑胺在臨床上的廣泛使用，陸續(xù)出現(xiàn)了耐藥菌株的報道，但目前其耐藥率依然很低，臨床上最常分離的耐藥細(xì)菌為糞腸球菌，衛(wèi)生部全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)（Mohnarin）2011—2012年革蘭陽性菌耐藥監(jiān)測報告顯示，只有0.4%的糞腸球菌對利奈唑胺不敏感[1]。腸球菌對利奈唑胺的耐藥機(jī)制主要與其細(xì)菌核糖體23s rRNA區(qū)域堿基突變和/或攜帶含有氯霉素-氟甲砜霉素耐藥（chloramphenicolflorfenicol resistance，cfr） 基因的質(zhì)粒有關(guān)。本研究分析了近期從臨床分離的4株利奈唑胺不敏感糞腸球菌的耐藥基因突變情況。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

菌株分離自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院收治的4例患者的引流液和中段尿樣本，其中3株菌對利奈唑胺耐藥，1株菌對利奈唑胺中介，見表1。采用法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的Vitek 2 Compact 全自動微生物分析系統(tǒng)及配套的鑒定卡（GP）和藥物敏感性卡（GP-68）進(jìn)行菌株鑒定及體外藥物敏感性試驗，采用E-test法確認(rèn)利奈唑胺最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值，質(zhì)控菌株為糞腸球菌（ATCC 29212），體外藥物敏感性試驗結(jié)果根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） M100-S26標(biāo)準(zhǔn)判讀。

表1 4株利奈唑胺不敏感糞腸球菌的基本情況

1.2 耐藥基因擴(kuò)增

糞腸球菌基因組含有4個23S rRNA拷貝基因，突變的數(shù)量和位置與其耐藥程度有關(guān)，根據(jù)文獻(xiàn)[2-3]設(shè)計合成聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物，23S rRNA V區(qū)靶基因引物、cfr基因引物、23S rRNA4個拷貝基因引物（表2）。擴(kuò)增采用PrimeSTAR HS DNA聚合酶（日本TaKaRa公司），PCR體系為：DNA模板1 μL，引物1 μL（前向和逆向引物各0.5 μL），PrimeSTAR預(yù)混液25 μL，加去離子水至50 μL。擴(kuò)增條件：98 ℃10 s，55 ℃ 15 s ，72 ℃ 90 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸2 min。擴(kuò)增后取5 μL于1%瓊脂糖凝膠100 V電泳60 min，觀察擴(kuò)增結(jié)果，余下45 μL送生工生物（上海）有限公司測序。

1.3 序列分析

23s rRNA序列采用Invitrogen公司AlignX軟件進(jìn)行擬合和突變分析，參考序列為Enterococcus faecalisV583 （GB：AE016830）。

2 結(jié)果

2.1 23S rRNA 區(qū)和cfr基因的擴(kuò)增

4株糞腸球菌均未擴(kuò)增出cfr基因，23S rRNA V區(qū)擴(kuò)增片段經(jīng)膠回收和T載體克隆后隨機(jī)挑選6個菌落抽提質(zhì)粒測序，未檢出最常見的G2576U突變。見圖1。

表2 本研究所用的擴(kuò)增基因的引物序列

圖1 23S rRNA V區(qū)序列比對

2.2 基因組4個拷貝23S rRNA基因的擴(kuò)增

對糞腸球菌基因組4個23S rRNA拷貝基因分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，結(jié)果顯示僅1株菌（1512104）存在G2576U突變，4株菌均存在U2826C突變，菌株1512160存在G2389A突變，菌株1512163存在U2363C和A2881G突變。見圖2。

圖2 4株糞腸球菌基因組23S rRNA序列比對

2.3 同期利奈唑胺敏感糞腸球菌4個拷貝23S rRNA基因的擴(kuò)增

因為23S rRNA基因和野生型標(biāo)準(zhǔn)株V583相比出現(xiàn)的主要突變類型是U2826C，位于23S rRNA V區(qū)外圍，本研究進(jìn)一步擴(kuò)增同期分離的對利奈唑胺敏感的3株糞腸球菌和標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 29212）。結(jié)果顯示，3株臨床分離的利奈唑胺敏感糞腸球菌和標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 29212）的23S rRNA基因第2826位均為胞嘧啶C。其余序列與野生型標(biāo)準(zhǔn)株 V583相比均無突變。見圖3。

圖3 3株利奈唑胺敏感糞腸球菌和標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 29212）的測序結(jié)果

3 討論

抗菌藥物耐藥是全球性難題，可造成大量的社會衛(wèi)生資源的浪費和人民生命財產(chǎn)的損失[4]。目前，細(xì)菌耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，根據(jù)2015年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測報告，耐萬古霉素糞腸球菌和屎腸球菌分別為0.4%和2.9%。利奈唑胺被認(rèn)為是治療VRE感染的理想藥物。隨著利奈唑胺在臨床的大量使用，腸球菌對利奈唑胺耐藥現(xiàn)象也漸有報道[5-7]，較明確的耐藥機(jī)制主要涉及靶位突變、cfr的產(chǎn)生等。

本研究首先采用PCR進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)4株利奈唑胺不敏感糞腸球菌均不含有cfr基因，推測其耐藥的主要機(jī)制是23S rRNA發(fā)生耐藥突變。進(jìn)一步擴(kuò)增23S rRNA V區(qū)并測序，并沒有檢測出文獻(xiàn)報道的最常見的G2576U突變[7-10]。進(jìn)一步分別擴(kuò)增4個拷貝23S rRNA基因（圖4）并測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅1株菌存在1拷貝G2576U，4株菌均存在U2826C突變，另外還分別存在G2389A、U2363C和A2881G突變，我們推測可能是U2826C突變導(dǎo)致了菌株對利奈唑胺不敏感。因為4株細(xì)菌16拷貝均出現(xiàn)U2826C突變，并且第2 826位堿基位于可變區(qū)的外圍，可能是標(biāo)準(zhǔn)序列V583發(fā)生了無義突變，我們進(jìn)一步擴(kuò)增了同時期臨床分離的對利奈唑胺敏感的糞腸球菌和標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 29212），結(jié)果其第2 826位堿基均為胞嘧啶，說明第2 826位可能野生型就是胞嘧啶，且突變不會對利奈唑胺的耐藥性發(fā)生變化。很多體外試驗和臨床數(shù)據(jù)支持抗菌藥物的選擇壓力促進(jìn)耐藥突變產(chǎn)生的觀點[11-12]，但耐藥突變的產(chǎn)生和使用利奈唑胺的關(guān)系并不確定，有未使用利奈唑胺的患者分離到耐藥株的報道[13]，在我們分離的4例患者中有3例曾使用利奈唑胺，另1例未使用利奈唑胺為門診患者。

已發(fā)現(xiàn)的糞腸球菌對利奈唑胺的耐藥機(jī)制主要涉及23S rRNA突變，導(dǎo)致抗菌藥物和靶位結(jié)合障礙，和其他抗菌藥物不存在交叉耐藥，我們分離的4株利奈唑胺不敏感糞腸球菌均對萬古霉素敏感。泰地唑胺是新的噁唑烷酮類抗菌藥物，CLSI M100 S26增加了革蘭陽性球菌泰地唑胺的MIC判斷標(biāo)準(zhǔn)，美國食品與藥品監(jiān)督管理局也批準(zhǔn)泰地唑胺用于治療金黃色葡萄球菌（甲氧西林耐藥菌株和甲氧西林敏感菌株）、各種鏈球菌及腸球菌等革蘭陽性細(xì)菌引起的成人急性細(xì)菌性皮膚和皮膚組織感染。有報道顯示，盡管與利奈唑胺作用機(jī)制相同，但利奈唑胺耐藥并不表示泰地唑胺也耐藥，而利奈唑胺敏感則提示泰地唑胺敏感[14]。因為缺乏泰地唑胺體外藥物敏感性試驗的檢測藥物，所以尚不清楚這4株菌是否對泰地唑胺不敏感。

體外試驗顯示，在長時間利奈唑胺的選擇壓力下，腸球菌23S rRNA基因會發(fā)生突變，且突變的拷貝數(shù)量會增加，細(xì)菌通過同源重組的方式，野生株的基因逐步被突變株的基因所取代，推斷出現(xiàn)突變的拷貝數(shù)與耐藥水平相關(guān)[11，15]。此次檢測，雖然這3株菌分離自不同病區(qū)的患者，也沒有直接證據(jù)表明是同源菌，但結(jié)合醫(yī)院感染特點和藥物敏感性譜分析不排除醫(yī)院感染同源菌的可能，另1株分離自門診患者。尚不清楚4個拷貝基因均發(fā)生突變的原因，有待進(jìn)一步研究。

總之，我們分析了臨床分離到的4株利奈唑胺不敏感糞腸球菌23S RNA基因的突變情況，結(jié)合同期分離的敏感株和質(zhì)控菌株，發(fā)現(xiàn)耐藥的主要原因是23S rRNA散發(fā)突變，提示我們應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)抗菌藥物合理使用管理和醫(yī)院感染預(yù)防控制工作，防止多重耐藥菌的出現(xiàn)和在醫(yī)院蔓延。

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