瞬時受體電位通道5時間分辨熒光免疫分析法的建立和驗證

陸揚帆， 黃 飚， 馬 鑫

（1.江南大學藥學院，江蘇 無錫 214000；2.江蘇省原子醫(yī)學研究所，江蘇 無錫 214063）

細胞膜瞬時受體電位通道5（transient receptor potential channel 5，TRPC5）是一類具有四聚體結(jié)構(gòu)的非選擇性陽離子通道，對Ca2+通透，參與細胞對滲透壓反應(yīng)的調(diào)控[1-2]。有研究結(jié)果表明，細胞膜微泡（extracellular vesicle，EV）是耐藥乳腺腫瘤細胞受到藥物刺激后特異性從乳腺腫瘤細胞表面通過細胞膜出芽方式大量生成的直徑為100～500 nm的膜泡，該EV包裹化療藥物并攜帶TRPC5等關(guān)鍵蛋白進入血循環(huán)[3-5]，TRPC5或許可作為乳腺癌耐藥診斷的標志物。本研究采用時間分辨熒光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）建立了TRPC5 TRFIA。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

MUC1 抗體（ab70475）購自美國Abcam公司，Sulfo-SMCC、KLH、Sulfolink Resin 購自美國Pierce公司，福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑購自美國Sigma公司，TRPC5多肽標準品由上海強耀生物科技有限公司合成。透析袋購自美國Viskase公司，PD-10柱購自美國BioRad公司，免疫磁珠購自蘇州Beaver公司，Auto DELFIA 1235全自動TRFIA檢測儀為美國PE - Wallac公司產(chǎn)品。

1.2 試劑的配制

1.2.1 TRPC5標準品溶液配制 將TRPC5標準品稀釋成0 、5 、10 、20 、40 、50 、80 、100 、200、400、500 、800 和1 000 ng/mL系列濃度，稀釋液為0.1 mol/L pH值7.5的磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）。

1.2.2 β2緩沖液 分別稱量9 g NaCl、5 g牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、20 μmol 二乙烯三胺五乙酸和0.5 g NaN3，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.8。

1.2.3 洗脫緩沖液 分別稱量9 g NaCl、3 g BSA、1 g NaN3，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.8。

1.2.4 包被緩沖液 分別稱量1.59 gNa2CO3、2.96 g NaHCO3，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為9.6。

1.2.5 平衡緩沖液 分別稱量0.9 g NaCl、1.59 g Na2CO3、2.96 g NaHCO3，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為8.5。

1.3 方法

1.3.1 抗TRPC5多克隆抗體的制備 由上海強耀生物科技有限公司制備?？筎RPC5多克隆抗體TRPC5多肽是一種半抗原，沒有免疫原性，故采用TRPC5與血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）耦聯(lián)作為免疫抗原免疫新西蘭大白兔。具體方法為：第1天，取抗原1 mL加入1 mL福氏完全佐劑，乳化，于大白兔頸背部皮下多點注射；第14、28、42天，每次取抗原1 mL加入1 mL福氏不完全佐劑，乳化，于大白兔頸背部皮下多點注射；第52天，于頸動脈取血，將大白兔處死，兔血在4 ℃放置過夜，4 ℃ 10 000×g離心30 min，收集上清；親和純化血清后，將其分裝備用。

1.3.2 黏蛋白（mucin1，MUC1）包被磁珠的制備 參考免疫磁珠試劑盒方法包被磁珠，具體步驟為：取50 μg MUC1用平衡緩沖液配成濃度 ≥3.0 mg/mL 的蛋白溶液，取500 μL磁珠懸浮液于1.5 mL聚丙烯離心管中，將聚丙烯離心管置于磁性分離架內(nèi)，富集磁珠，棄上清液，加1 mL 2～8 ℃的洗滌液A于離心管中，渦旋15 s，使磁珠混合均勻。將Eppendorf管置于磁性分離架內(nèi)，富集磁珠，去除上清液。加200 μL蛋白溶液于聚丙烯離心管中，渦旋30 s，使其混合均勻。將聚丙烯離心管渦旋15 s，置于垂直混合儀上，4 ℃反應(yīng)過夜。采用磁性分離架富集磁珠，加1 mL 封閉液于Eppendorf管中，渦旋30 s，將Eppendorf管置于磁性分離架內(nèi)，富集磁珠，棄上清液。加1 mL 封閉液于聚丙烯離心管中，渦旋30 s，將聚丙烯離心管置于垂直混合儀中室溫反應(yīng)2 h。將聚丙烯離心管置于磁性分離架內(nèi)，富集磁珠，棄上清液。加1 mL 超純水于聚丙烯離心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，棄上清液。加1 mL 儲存液于聚丙烯離心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，棄上清液。重復(fù)該操作2次，加入1 mL 儲存液于聚丙烯離心管中，充分混合，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 包被板固相抗原的制備 將TRPC5多肽用包被緩沖液稀釋成0.19 μg/L的包被液，在96孔包被板中各孔加100 μL，震蕩混勻，4 ℃放置過夜。棄去包被液，拍干殘留液體后，每孔加入200 μL含3 g/L BSA的上述緩沖液封閉，室溫放置2 h。棄去封閉液，拍干殘留液體后，于烘箱中干燥，置-20 ℃保存。

1.3.4 Eu3+-羊抗兔抗體的制備 取溶解于50 mmol/L PBS pH值7.0緩沖液的羊抗兔抗體5～10 mg，經(jīng)截留相對分子質(zhì)量為50 000的超濾管轉(zhuǎn)換緩沖體系，將緩沖體系換為平衡緩沖液。取500～1 000 μL轉(zhuǎn)換緩沖體系后的羊抗兔抗體于1.5 mL 離心管中，加入0.2～0.4 mg的Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸，25 ℃震蕩混合，反應(yīng)過夜。反應(yīng)液經(jīng)用80 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷-HCl pH值7.8緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱（1 cm×40 cm）層析，稀釋分裝備用。

1.3.5 檢測步驟 （1）樣本預(yù)處理：為了盡可能排除血清中其他因素對檢測結(jié)果的影響，先進行樣本預(yù)處理。用促凝血清管采集新鮮血液，1 000×g離心5 min后收集上清；用包被有MUC1抗體的免疫磁珠與收集到的上清于25 ℃震蕩孵育1 h；用磁力架吸附磁珠，棄去上清液，用PBS柔和清洗磁珠；用磁力架吸附磁珠，棄去上清液，再用PBS重懸作為待測樣本。（2）TRPC5 TRFIA檢測步驟：取包被有包被原（TRPC5多肽）的96孔包被板，加50 μL TRPC5標準品或已經(jīng)用MUC1磁珠預(yù)處理過的待測樣本到各自的微孔中，加50 μL用洗脫緩沖液稀釋的抗TRPC5抗體，于25 ℃振蕩孵育1 h，洗滌4次，加入用β2緩沖液稀釋的100 μL Eu3+-羊抗兔抗體，于25 ℃振蕩孵育1 h，洗滌6次，加入200 μL增強液振蕩5 min后測量熒光強度，根據(jù)標準曲線計算樣本中的TRPC5含量。

1.3.6 離心法收集血清樣本中的EV 收集血清樣本，按梯度進行離心： 以4 000×g 4 ℃離心10 min，取上清；以12 000×g 4 ℃離心30 min，取上清；以100 000×g 4 ℃離心2 h，棄去上清，PBS重懸沉淀，收集EV。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)分析采用配對t檢驗及兩變量的相關(guān)和回歸分析。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 抗TRPC5抗體稀釋

在TRPC5多肽板條中加分析緩沖液稀釋的不同濃度的抗TRPC5抗體，抑制率為最高濃度（1∶50稀釋）兔血清結(jié)合率的30%～50%時對應(yīng)的稀釋度為1∶1 000～1∶2 000，因此合適的工作濃度應(yīng)在此范圍內(nèi)，選擇1∶1 000稀釋。見圖1。

2.2 TRPC5多肽固相抗原包被量的優(yōu)化

用包被液將TRPC5多肽稀釋為不同濃度進行包被，采用TRPC5 TRFIA檢測，作各濃度點熒光強度的雙對數(shù)函數(shù)曲線，見圖2。當TRPC5固相抗原包被量為0.19 μg/mL時，其曲線的斜率較大，不同濃度TRPC5多肽區(qū)分度較高，因此固相抗原選用濃度為0.19 μg/mL TRPC5的多肽進行包被。

圖1 TRPC5 TRFIA抗體稀釋度曲線

圖2 不同濃度TRPC5多肽包被的TRPC5 TRFIA標準曲線

2.3 TRPC5 TRFIA的考核

TRPC5 TRFIA的結(jié)果經(jīng)對數(shù)函數(shù)處理所得的標準曲線見圖3。

圖3 TRPC5 TRFIA標準曲線

2.3.1 方法的敏感性和穩(wěn)定性 以零劑量點熒光強度x -2s后的熒光強度在標準曲線上得到的相應(yīng)值為檢測的敏感性，TRPC5 TRFIA的敏感性為1 ng/mL。精確度測量范圍變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）＜10 %，即TRPC5濃度為5～500 ng/mL，見圖4。運用TRPC5 TRFIA檢測，3個效應(yīng)點檢測值ED80、ED50、ED20分別為（4.68±0.13）、（321.66±2.77）和（714.42±4.07）ng/mL。說明劑量反應(yīng)曲線的位置漂移較小，方法的穩(wěn)定性較好。

圖4 TRPC5 TRFIA精確度曲線

2.3.2 方法的精密度和回收率 隨機抽取的96孔微孔板反應(yīng)條經(jīng)Eu3+-羊抗兔抗體示蹤的結(jié)果見表1。經(jīng)統(tǒng)計學分析，各孔計數(shù)值CV為5.5%，其中4條反應(yīng)板的CV均＜10.0%，說明此種96孔微孔板各孔的均一性及重復(fù)性良好，完全能夠滿足TRFIA的要求。見表1。

以健康女性樣本為空白血清基質(zhì)，在其中添加不同量的TRPC5標準品，使其最終濃度為 0～1 000 ng/mL，應(yīng)用TRPC5 TRFIA檢測各個樣本TRPC5的濃度，計算回收率，見表2。5個空白添加樣本的平均回收率為94.61%，不同加樣量的平均空白加樣回收率均在85.00%～115.00%之間，能滿足免疫分析的要求，表明該方法具有較好的準確性。

表1 96孔板均一性測定

表2 間接TRFIA測定樣本中TRPC5的回收率

2.3.3 TRPC5 TRFIA的臨床應(yīng)用 收集臨床血清樣本，乳腺癌化療耐藥患者21例，化療耐受尚可患者21例，正常對照者12名，使用TRPC5 TRFIA檢測乳腺癌來源TRPC5含量，結(jié)果見圖5。正常對照組與化療耐受尚可組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而化療耐藥組與化療耐受尚可組比較，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.000 1）。

2.3.4 MUC1磁珠富集EV與離心收集EV效果的比較 將上述收集到的血清樣本，用超高速離心方法分離收集其中的EV，取與磁珠富集方法收集EV過程中等量的血清所收集到的EV，直接使用TRPC5 TRFIA檢測其中TRPC5的含量，并與磁珠富集方法收集EV的結(jié)果進行相關(guān)性分析，2種方法檢測的結(jié)果呈正相關(guān)（r2=0.695 8，p＜0.000 1）。見圖6。

圖5 TRPC5 TRFIA臨床檢測結(jié)果

圖6 磁珠富集EV與離心收集EV的相關(guān)性

3 討論

乳腺癌是女性常見的腫瘤，嚴重威脅女性的身心健康?；瘜W藥物治療是乳腺癌的主要治療手段之一，但90%以上腫瘤患者死于不同程度的化療耐藥。對化療藥物產(chǎn)生耐藥已經(jīng)成為腫瘤治療的一大難題。目前，早期診斷腫瘤的最新、最有效的方法是檢測血中的腫瘤標志物。腫瘤標志物是指在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中，能反應(yīng)細胞癌變的一些細胞內(nèi)物質(zhì)。臨床上通過對各種腫瘤標志物的檢測，可以對相應(yīng)腫瘤進行早期診斷、療效觀察和腫瘤復(fù)發(fā)狀況監(jiān)測[6-7]。因此，在深入研究耐藥機制的基礎(chǔ)上，開發(fā)腫瘤耐藥分子的診斷指標、方法，實現(xiàn)試劑化，從而做到耐藥早期動態(tài)監(jiān)測，在現(xiàn)階段對于乳腺癌耐藥的診療至關(guān)重要，也為優(yōu)化藥物結(jié)構(gòu)設(shè)計、研發(fā)耐藥逆轉(zhuǎn)藥物提供有益借鑒，因而具有重大而現(xiàn)實的社會價值。

MUC1在正常細胞表達時是一種跨膜糖蛋白，正常情況下，在乳腺、胃腸道及泌尿生殖道的上皮細胞頂端表達，糖基化完全。MUC1對正常上皮起潤滑和保護、介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞黏附作用。在乳腺癌細胞株MCF-7中通過磷酸化，MUC1能結(jié)合Rrb/SOS，參與受體酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而酪氨酸磷酸化是膜受體參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個關(guān)鍵步驟[8]。乳腺癌MUC1的表達特點為：高表達、異常表達低；糖基化、高唾液酸化；頂端定位不清，極性混亂；細胞漿和細胞表面都有過度表達，并且這些分子會從乳腺癌細胞進入血清?；讟尤橄侔┗颊吒弑磉_ MUC1，約有92% 的患者能檢測出過表達的MUC1。

免疫磁珠，也稱免疫磁性微球，是一種均勻、具有超順磁性及保護性殼的球形小粒子，基本上由載體微球和免疫配基結(jié)合而成。免疫磁珠技術(shù)，是一種以特異的抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫學檢測和分離技術(shù)，以抗體包被的磁珠為載體，通過抗體與反應(yīng)介質(zhì)中特異性抗原結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，此復(fù)合物在外加磁場的作用下發(fā)生定向移動，從而達到分離抗原的目的[9-10]。

TRFIA是超微量檢測領(lǐng)域中一項新興的檢測技術(shù)，在醫(yī)學檢驗方面已得到長足發(fā)展，其是利用免疫反應(yīng)的高度特異性與標記示蹤物的高度敏感性相結(jié)合而建立的一類微量物質(zhì)檢測技術(shù)。全自動TRFIA檢測限為10～18 mol/L，大大優(yōu)于酶聯(lián)免疫吸附試驗的10-10mol/L和放射免疫法的10-12mol/L，所以世界衛(wèi)生組織推薦將此技術(shù)作為醫(yī)學領(lǐng)域中的超微量檢測技術(shù)[11]。采用TRFIA進行TRPC5檢測的敏感性可達1 ng/mL，檢測范圍可達5～500 ng/mL，根據(jù)臨床樣本檢測分析，發(fā)現(xiàn)其對于乳腺癌化療耐藥及化療耐受尚可患者有一定的區(qū)分能力，值得加大臨床樣本量進行進一步分析。

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