朱 俊,朱宇清,朱嶺峰,蔣玲麗,徐 翀
(上海市臨床檢驗中心,上海 200126)
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是導致肝硬化和肝癌的首要原因,全球大約有2.4億HBV感染者[1],我國的乙型肝炎患者達1.2億[2]。由于HBV雙鏈DNA的復制過程中RNA等中間產物和逆轉錄酶的作用,以及DNA聚合酶缺乏校正功能而使HBV基因組具有較大的變異性[3]。迄今為止,根據HBV全基因組序列分析將HBV分為10種(A~J)基因型和多種亞型,不同基因型之間的核酸序列異質性≥8%,不同亞型之間序列差異為4%~7%[2,4-6]。有研究結果表明,HBV基因型與乙型肝炎臨床表現的異質性、對抗病毒治療應答及預后有關[7-8]。目前,國內外對于HBV基因分型多采用測序方法,但測序方法存在繁瑣耗時、成本較高的不足。我們研發(fā)了一種基于流式熒光點陣技術(又稱液態(tài)芯片法)的HBV基因型B型和C型的檢測方法,具有特異性強、操作簡便靈活并易自動化的特點。
收集2015年4月上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院檢驗科采用測序法進行HBV基因分型的血清樣本67份,其中B型24份、C型43份。
1.2.1 儀器 (1)TC-96/G/H(b)A Life Pro梯度基因擴增儀(杭州博日科技有限公司)。(2)EPS100核酸電泳儀(上海天能科技有限公司)。(3)FR-200A全自動紫外與可見分析裝置(上海復日科技有限公司)。(4)Luminex 200多功能流式點陣(液相芯片)儀(美國Luminex公司)。
1.2.2 試劑 (1)DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)。(2)BestarTaq DNA Polymerase DNA聚合酶(德國DBI Bioscience公司)。(3)引物和探針由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。測序引物 HBV B型擴增引物:HBV-BF 5'-GTCCTCTAATTCCAGGAT-3',其中5'端第5個T用生物素標記,HBV-BR 5'-CGTAGGTTTTGTACAGCAACGT-3'。HBV C型擴增引物:HBV-CF 5'-ACAACATCTTGAGTCCCTTCTT-3',其中5'端第5個T用生物素標記,HBV-CR 5'-CCATGAAGTTAAGGGAGTTGC-3'。探針(5'起第9個堿基T用氨基修飾):HBV B型探針ACTCCTGCTCAAGGAACCTCTA;HBV C型探針TCTTTGGGTATACATTTAAACCCTAA。(4)鏈霉親和素-藻紅蛋白(美國Invitrogen公司)。(5)熒光編號的(表面羧基修飾)聚苯乙烯微球(美國Luminex公司)。
1.3.1 核酸探針與微球偶聯(lián) 從探針5' 起第9個堿基T氨基化,聚苯乙烯微球表面用羧基修飾。探針通過修飾的氨基偶聯(lián)至修飾羧基的微球表面。
1.3.2 多重聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)產物與探針雜交 PCR引物5'端第5個T用生物素標記,PCR擴增產物如與微球表面探針互補,則生物素連接至微球表面,加入鏈霉親和素-藻紅蛋白后即可通過鏈霉親和素與生物素的結合而使藻紅蛋白熒光標記至微球。微球表面的藻紅蛋白熒光在激光激發(fā)下發(fā)光。見圖1。
圖1 熒光點陣技術原理
1.4.1 多重PCR擴增 (1)DNA提?。焊鶕﨑NA提取試劑盒的說明書進行DNA提取。(2)反應體系組成:模板DNA2 μL,上、下游引物2 μL,PCR預混液(含熱啟動TaqDNA酶、MgCl2和 dNTP Mix)10 μL,雙蒸水6 μL,至總體積20 μL。(3)反應條件:95 ℃ 15 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 90 s,72 ℃ 90 s,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。反應產物于4 ℃保存。
1.4.2 雜交檢測 (1)探針與微球偶聯(lián):用蒸餾水將2種寡核苷酸探針溶解,調節(jié)濃度為1 mM/L。分別從2個熒光編碼的微球儲存懸液中取2.5×106個微球到2個離心管中。以蒸餾水將1 mM/L濃度探針進一步稀釋10倍,各取2 mL至混勻的相應的微球里混合并避光孵育30 min,探針通過修飾的氨基偶聯(lián)至修飾羧基的微球表面。偶聯(lián)后的微球經洗滌后用pH值8.0的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液將偶聯(lián)微球重懸浮。將分別偶聯(lián)B型和C型探針的2種微球等比例混合,各種微球的終濃度為1 500個/μL,2~8 ℃避光保存。(2)PCR產物與探針雜交:用雜交液將偶聯(lián)微球濃度稀釋至150個/μL作為微球工作液。取33 μL微球工作液,與多重PCR擴增產物和TE溶液(共17 μL)混合,在95~100 ℃孵育5 min以去除寡核苷酸的二級結構。在雜交溫度48 ℃下孵育反應60 min,加入10 μg/μL的鏈霉親和素-藻紅蛋白溶液75 μL后繼續(xù)孵育15 min完成雜交和熒光標記。(3)上機檢測:在Luminex 200液相芯片儀上,保持雜交溫度,對各反應孔進行檢測分析,測定平均熒光強度(mean fluorescence intensity, MFI)值。
1.4.3 結果分析 檢測時以不含有HBV DNA序列的質粒作為陰性對照,以MFI值>150作為陽性的判斷標準。陽性閾值是以10個陰性標本MFI的平均值加上2s確定。
將多重PCR擴增產物與結合B型和C型探針的2種微球在同一反應體系中雜交,Luminex 200液態(tài)芯片儀檢測結果顯示,人DNA、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, Sau)DNA和人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)DNA樣本的MFI均<150,顯示為陰性結果。18、19和20號樣本與C型探針雜交呈陽性反應,與B型探針不發(fā)生反應;33和34號樣本與B型探針雜交呈陽性反應,與C型探針不發(fā)生反應。這2個組雜交結果均與測序結果相符。見表1。
表1 B型和C型2種探針的特異性試驗
經測序法基因分型確定為B型的24份樣本中,23份經液態(tài)芯片法檢測獲得與測序同樣的結果,但有1份樣本同時顯示與B型和C型探針均有陽性雜交信號;經測序法確定為C型的43份樣本中,有40份樣本在液態(tài)芯片法的檢測中獲得與測序同樣結果,但有3份樣本同時與B型和C型探針有陽性雜交信號。見表2。
表2 液態(tài)芯片法與測序法結果的比較
HBV屬于嗜肝DNA病毒科家族,呈全球性分布,是導致人類嚴重慢性肝病(如慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌)的最主要原因[9]。自1965年BLUMBERG等[10]發(fā)現HBV后,HBV的第1種疫苗于5年后問世[11]。從1982年起,由于 >10億支HBV疫苗的使用,使全球感染HBV而導致的死亡率顯著下降[12]。但盡管如此,數億患者已經成為HBV慢性感染的事實使得根除乙型肝炎的任務異常艱巨。諾貝爾獎獲得者Blumberg教授認為可以通過3種重要的方式來根除HBV[11]:有效的全球疫苗接種、準確的診斷分析技術和對于HBV攜帶者的有效治療。而缺乏對HBV遺傳特性的了解,則難以達到此目的。
自從1988年OKAMOTO等[13]首次建立了HBV基因型的分型標準并將HBV分為A、B、C和D 4種基因型以后,經過NORDER等[14]、STUYVER等[15]、WU等[16]、YU等[17]和TATEMATSU等[18]的補充和發(fā)展,根據HBV全基因系列不同基因型間核酸序列差異≥8%、亞型之間差異為4%~7%的原則,至今可將HBV分為A~J共10種基因型,并可進一步分為諸多亞型(以數字表示)。HBV基因分型與之前報道的根據HBV表面抗原2對互相排斥的亞型決定簇(d/y和w/r)而建立的血清分型部分相關[6],2種分型方式并不能建立完全的對應關系,比如血清型adw并不只存在于1種基因型中[19]。目前認為以基因型來反映HBV的變異更為準確。HBV基因型的分布具有顯著的民族和地理區(qū)域差異[2],并且與乙型肝炎的臨床表現、病程、抗病毒治療應答以及預后有關[7-8]。因此,準確的HBV基因分型對于乙型肝炎的預防、診斷、治療以及預后判斷均有重要意義。
迄今為止,通過與美國國家生物技術信息中心(the National Center for Biotechnology Information, NCBI)網站上的BLAST軟件的比對,對HBV進行全基因組序列分析是區(qū)分HBV基因型和亞型的“金標準”。其他用于HBV基因分型的分子生物學方法還包括:PCR-限制性片段長度法、型特異性引物PCR、寡核苷酸基因芯片法、限制性片段質譜多態(tài)性技術、質譜分析、實時熒光PCR、線形探針反向雜交技術以及反向點雜交等方法。但這些方法的缺點是不能準確分型、容易受基因組堿基突變而影響引物和DNA或探針和DNA的配對而導致分型結果難以歸類,檢測成本高、需要特殊儀器等[20]。測序法因其可以直接分析HBV全基因組的序列,所以分型結果最為可靠。因此,雖然有多種HBV分型方法,基因測序仍然是HBV分型的“金標準”。但是,測序方法檢測成本較高、技術相對復雜且需要測序儀器,故不適合臨床廣泛應用[20]。
本研究以亞洲主要流行的B型和C型HBV為研究目標,研發(fā)了一種利用多重PCR技術結合液態(tài)芯片技術對HBV進行基因分型的方法,目前市場上尚無相同產品。引物和探針的設計參考了世界衛(wèi)生組織等機構推薦的病毒株序列和引物序列,與NCBI的HBV核酸數據庫進行序列比對,以確保所設計引物和探針序列的特異性、穩(wěn)定性和代表性,并同時兼顧我國地區(qū)高發(fā)毒株的情況。本研究檢測了經測序確認的B型和C型HBV患者樣本各20份,結果顯示自建的液態(tài)芯片法與測序法結果的一致性高達 94%, 達到了預期的目的。值得指出的是,在24份測序結果為B型患者中有1份樣本檢測出B型和C型雙陽性探針信號;43份樣本測序法結果為C型的患者中有3份樣本檢測出B和C型雙陽性探針信號,我們認為這4份樣本的患者可能是HBV B型和C型混合感染。KAO等[21]于2002年即報道了在日本獻血員中發(fā)現有HBV的B型和C型混合型感染的存在。對于HBV混合型感染的鑒定,采用型特異性引物擴增的方法優(yōu)于測序方法,因為如果只對PCR擴增產物進行直接測序,通常只能檢測到優(yōu)勢毒株的基因型,載量低的毒株序列大多難以測出,除非我們對PCR產物先進行克隆,再選取多個克隆進行測序,這樣才有可能檢測到弱勢基因型的毒株,但采取這樣的技術需要更長的檢測周期,在臨床常規(guī)檢測中并不可行。本研究設計的液態(tài)芯片法初步顯示能夠更敏感和特異地檢測出混合型感染,但還需對這4份樣本作進一步驗證,以確定本技術在鑒定HBV混合感染中的優(yōu)勢。
本研究建立的HBV液態(tài)芯片法有廣泛的應用前景。實驗所用的微球如用不同強度的二維熒光編碼,可以做到在同一個體系中同時檢測到100多個不同熒光編碼的微球群體,通過對每個微球群體標記不同的核酸探針,就可以在同一個體系中同時檢測100多個分析物。因此,本方法開發(fā)成功的意義在于不僅能有效地檢測HBV和鑒定其亞型,為其他各種病原體的確定及其亞型鑒定、病原體多種耐藥基因分析等提供多重、簡便、快速檢測的可能,甚至還能為一些復雜性疾病、遺傳性疾病多基因多位點實現多重平行檢測提供可行的方法。
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