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    流式熒光點陣技術(shù)在乙型肝炎病毒基因分型中的應(yīng)用

    2018-06-04 07:41:22朱宇清朱嶺峰蔣玲麗
    檢驗醫(yī)學(xué) 2018年5期
    關(guān)鍵詞:檢測

    朱 俊,朱宇清,朱嶺峰,蔣玲麗,徐 翀

    (上海市臨床檢驗中心,上海 200126)

    乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是導(dǎo)致肝硬化和肝癌的首要原因,全球大約有2.4億HBV感染者[1],我國的乙型肝炎患者達1.2億[2]。由于HBV雙鏈DNA的復(fù)制過程中RNA等中間產(chǎn)物和逆轉(zhuǎn)錄酶的作用,以及DNA聚合酶缺乏校正功能而使HBV基因組具有較大的變異性[3]。迄今為止,根據(jù)HBV全基因組序列分析將HBV分為10種(A~J)基因型和多種亞型,不同基因型之間的核酸序列異質(zhì)性≥8%,不同亞型之間序列差異為4%~7%[2,4-6]。有研究結(jié)果表明,HBV基因型與乙型肝炎臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性、對抗病毒治療應(yīng)答及預(yù)后有關(guān)[7-8]。目前,國內(nèi)外對于HBV基因分型多采用測序方法,但測序方法存在繁瑣耗時、成本較高的不足。我們研發(fā)了一種基于流式熒光點陣技術(shù)(又稱液態(tài)芯片法)的HBV基因型B型和C型的檢測方法,具有特異性強、操作簡便靈活并易自動化的特點。

    1 材料和方法

    1.1 研究對象

    收集2015年4月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗科采用測序法進行HBV基因分型的血清樣本67份,其中B型24份、C型43份。

    1.2 儀器與試劑

    1.2.1 儀器 (1)TC-96/G/H(b)A Life Pro梯度基因擴增儀(杭州博日科技有限公司)。(2)EPS100核酸電泳儀(上海天能科技有限公司)。(3)FR-200A全自動紫外與可見分析裝置(上海復(fù)日科技有限公司)。(4)Luminex 200多功能流式點陣(液相芯片)儀(美國Luminex公司)。

    1.2.2 試劑 (1)DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)。(2)BestarTaq DNA Polymerase DNA聚合酶(德國DBI Bioscience公司)。(3)引物和探針由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。測序引物 HBV B型擴增引物:HBV-BF 5'-GTCCTCTAATTCCAGGAT-3',其中5'端第5個T用生物素標記,HBV-BR 5'-CGTAGGTTTTGTACAGCAACGT-3'。HBV C型擴增引物:HBV-CF 5'-ACAACATCTTGAGTCCCTTCTT-3',其中5'端第5個T用生物素標記,HBV-CR 5'-CCATGAAGTTAAGGGAGTTGC-3'。探針(5'起第9個堿基T用氨基修飾):HBV B型探針ACTCCTGCTCAAGGAACCTCTA;HBV C型探針TCTTTGGGTATACATTTAAACCCTAA。(4)鏈霉親和素-藻紅蛋白(美國Invitrogen公司)。(5)熒光編號的(表面羧基修飾)聚苯乙烯微球(美國Luminex公司)。

    1.3 檢測技術(shù)原理

    1.3.1 核酸探針與微球偶聯(lián) 從探針5' 起第9個堿基T氨基化,聚苯乙烯微球表面用羧基修飾。探針通過修飾的氨基偶聯(lián)至修飾羧基的微球表面。

    1.3.2 多重聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)產(chǎn)物與探針雜交 PCR引物5'端第5個T用生物素標記,PCR擴增產(chǎn)物如與微球表面探針互補,則生物素連接至微球表面,加入鏈霉親和素-藻紅蛋白后即可通過鏈霉親和素與生物素的結(jié)合而使藻紅蛋白熒光標記至微球。微球表面的藻紅蛋白熒光在激光激發(fā)下發(fā)光。見圖1。

    圖1 熒光點陣技術(shù)原理

    1.4 方法

    1.4.1 多重PCR擴增 (1)DNA提?。焊鶕?jù)DNA提取試劑盒的說明書進行DNA提取。(2)反應(yīng)體系組成:模板DNA2 μL,上、下游引物2 μL,PCR預(yù)混液(含熱啟動TaqDNA酶、MgCl2和 dNTP Mix)10 μL,雙蒸水6 μL,至總體積20 μL。(3)反應(yīng)條件:95 ℃ 15 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 90 s,72 ℃ 90 s,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。反應(yīng)產(chǎn)物于4 ℃保存。

    1.4.2 雜交檢測 (1)探針與微球偶聯(lián):用蒸餾水將2種寡核苷酸探針溶解,調(diào)節(jié)濃度為1 mM/L。分別從2個熒光編碼的微球儲存懸液中取2.5×106個微球到2個離心管中。以蒸餾水將1 mM/L濃度探針進一步稀釋10倍,各取2 mL至混勻的相應(yīng)的微球里混合并避光孵育30 min,探針通過修飾的氨基偶聯(lián)至修飾羧基的微球表面。偶聯(lián)后的微球經(jīng)洗滌后用pH值8.0的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液將偶聯(lián)微球重懸浮。將分別偶聯(lián)B型和C型探針的2種微球等比例混合,各種微球的終濃度為1 500個/μL,2~8 ℃避光保存。(2)PCR產(chǎn)物與探針雜交:用雜交液將偶聯(lián)微球濃度稀釋至150個/μL作為微球工作液。取33 μL微球工作液,與多重PCR擴增產(chǎn)物和TE溶液(共17 μL)混合,在95~100 ℃孵育5 min以去除寡核苷酸的二級結(jié)構(gòu)。在雜交溫度48 ℃下孵育反應(yīng)60 min,加入10 μg/μL的鏈霉親和素-藻紅蛋白溶液75 μL后繼續(xù)孵育15 min完成雜交和熒光標記。(3)上機檢測:在Luminex 200液相芯片儀上,保持雜交溫度,對各反應(yīng)孔進行檢測分析,測定平均熒光強度(mean fluorescence intensity, MFI)值。

    1.4.3 結(jié)果分析 檢測時以不含有HBV DNA序列的質(zhì)粒作為陰性對照,以MFI值>150作為陽性的判斷標準。陽性閾值是以10個陰性標本MFI的平均值加上2s確定。

    2 結(jié)果

    2.1 特異性試驗

    將多重PCR擴增產(chǎn)物與結(jié)合B型和C型探針的2種微球在同一反應(yīng)體系中雜交,Luminex 200液態(tài)芯片儀檢測結(jié)果顯示,人DNA、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, Sau)DNA和人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)DNA樣本的MFI均<150,顯示為陰性結(jié)果。18、19和20號樣本與C型探針雜交呈陽性反應(yīng),與B型探針不發(fā)生反應(yīng);33和34號樣本與B型探針雜交呈陽性反應(yīng),與C型探針不發(fā)生反應(yīng)。這2個組雜交結(jié)果均與測序結(jié)果相符。見表1。

    表1 B型和C型2種探針的特異性試驗

    2.2 液態(tài)芯片法與測序法結(jié)果比較

    經(jīng)測序法基因分型確定為B型的24份樣本中,23份經(jīng)液態(tài)芯片法檢測獲得與測序同樣的結(jié)果,但有1份樣本同時顯示與B型和C型探針均有陽性雜交信號;經(jīng)測序法確定為C型的43份樣本中,有40份樣本在液態(tài)芯片法的檢測中獲得與測序同樣結(jié)果,但有3份樣本同時與B型和C型探針有陽性雜交信號。見表2。

    表2 液態(tài)芯片法與測序法結(jié)果的比較

    3 討論

    HBV屬于嗜肝DNA病毒科家族,呈全球性分布,是導(dǎo)致人類嚴重慢性肝?。ㄈ缏愿窝?、肝硬化和肝細胞癌)的最主要原因[9]。自1965年BLUMBERG等[10]發(fā)現(xiàn)HBV后,HBV的第1種疫苗于5年后問世[11]。從1982年起,由于 >10億支HBV疫苗的使用,使全球感染HBV而導(dǎo)致的死亡率顯著下降[12]。但盡管如此,數(shù)億患者已經(jīng)成為HBV慢性感染的事實使得根除乙型肝炎的任務(wù)異常艱巨。諾貝爾獎獲得者Blumberg教授認為可以通過3種重要的方式來根除HBV[11]:有效的全球疫苗接種、準確的診斷分析技術(shù)和對于HBV攜帶者的有效治療。而缺乏對HBV遺傳特性的了解,則難以達到此目的。

    自從1988年OKAMOTO等[13]首次建立了HBV基因型的分型標準并將HBV分為A、B、C和D 4種基因型以后,經(jīng)過NORDER等[14]、STUYVER等[15]、WU等[16]、YU等[17]和TATEMATSU等[18]的補充和發(fā)展,根據(jù)HBV全基因系列不同基因型間核酸序列差異≥8%、亞型之間差異為4%~7%的原則,至今可將HBV分為A~J共10種基因型,并可進一步分為諸多亞型(以數(shù)字表示)。HBV基因分型與之前報道的根據(jù)HBV表面抗原2對互相排斥的亞型決定簇(d/y和w/r)而建立的血清分型部分相關(guān)[6],2種分型方式并不能建立完全的對應(yīng)關(guān)系,比如血清型adw并不只存在于1種基因型中[19]。目前認為以基因型來反映HBV的變異更為準確。HBV基因型的分布具有顯著的民族和地理區(qū)域差異[2],并且與乙型肝炎的臨床表現(xiàn)、病程、抗病毒治療應(yīng)答以及預(yù)后有關(guān)[7-8]。因此,準確的HBV基因分型對于乙型肝炎的預(yù)防、診斷、治療以及預(yù)后判斷均有重要意義。

    迄今為止,通過與美國國家生物技術(shù)信息中心(the National Center for Biotechnology Information, NCBI)網(wǎng)站上的BLAST軟件的比對,對HBV進行全基因組序列分析是區(qū)分HBV基因型和亞型的“金標準”。其他用于HBV基因分型的分子生物學(xué)方法還包括:PCR-限制性片段長度法、型特異性引物PCR、寡核苷酸基因芯片法、限制性片段質(zhì)譜多態(tài)性技術(shù)、質(zhì)譜分析、實時熒光PCR、線形探針反向雜交技術(shù)以及反向點雜交等方法。但這些方法的缺點是不能準確分型、容易受基因組堿基突變而影響引物和DNA或探針和DNA的配對而導(dǎo)致分型結(jié)果難以歸類,檢測成本高、需要特殊儀器等[20]。測序法因其可以直接分析HBV全基因組的序列,所以分型結(jié)果最為可靠。因此,雖然有多種HBV分型方法,基因測序仍然是HBV分型的“金標準”。但是,測序方法檢測成本較高、技術(shù)相對復(fù)雜且需要測序儀器,故不適合臨床廣泛應(yīng)用[20]。

    本研究以亞洲主要流行的B型和C型HBV為研究目標,研發(fā)了一種利用多重PCR技術(shù)結(jié)合液態(tài)芯片技術(shù)對HBV進行基因分型的方法,目前市場上尚無相同產(chǎn)品。引物和探針的設(shè)計參考了世界衛(wèi)生組織等機構(gòu)推薦的病毒株序列和引物序列,與NCBI的HBV核酸數(shù)據(jù)庫進行序列比對,以確保所設(shè)計引物和探針序列的特異性、穩(wěn)定性和代表性,并同時兼顧我國地區(qū)高發(fā)毒株的情況。本研究檢測了經(jīng)測序確認的B型和C型HBV患者樣本各20份,結(jié)果顯示自建的液態(tài)芯片法與測序法結(jié)果的一致性高達 94%, 達到了預(yù)期的目的。值得指出的是,在24份測序結(jié)果為B型患者中有1份樣本檢測出B型和C型雙陽性探針信號;43份樣本測序法結(jié)果為C型的患者中有3份樣本檢測出B和C型雙陽性探針信號,我們認為這4份樣本的患者可能是HBV B型和C型混合感染。KAO等[21]于2002年即報道了在日本獻血員中發(fā)現(xiàn)有HBV的B型和C型混合型感染的存在。對于HBV混合型感染的鑒定,采用型特異性引物擴增的方法優(yōu)于測序方法,因為如果只對PCR擴增產(chǎn)物進行直接測序,通常只能檢測到優(yōu)勢毒株的基因型,載量低的毒株序列大多難以測出,除非我們對PCR產(chǎn)物先進行克隆,再選取多個克隆進行測序,這樣才有可能檢測到弱勢基因型的毒株,但采取這樣的技術(shù)需要更長的檢測周期,在臨床常規(guī)檢測中并不可行。本研究設(shè)計的液態(tài)芯片法初步顯示能夠更敏感和特異地檢測出混合型感染,但還需對這4份樣本作進一步驗證,以確定本技術(shù)在鑒定HBV混合感染中的優(yōu)勢。

    本研究建立的HBV液態(tài)芯片法有廣泛的應(yīng)用前景。實驗所用的微球如用不同強度的二維熒光編碼,可以做到在同一個體系中同時檢測到100多個不同熒光編碼的微球群體,通過對每個微球群體標記不同的核酸探針,就可以在同一個體系中同時檢測100多個分析物。因此,本方法開發(fā)成功的意義在于不僅能有效地檢測HBV和鑒定其亞型,為其他各種病原體的確定及其亞型鑒定、病原體多種耐藥基因分析等提供多重、簡便、快速檢測的可能,甚至還能為一些復(fù)雜性疾病、遺傳性疾病多基因多位點實現(xiàn)多重平行檢測提供可行的方法。

    [1]OTT J J, STEVENS G A, GROEGER J, et al.Global epidemiology of hepatitis B virus infection:new estimates of age-specific HBsAg seroprevalence and endemicity[J]. Vaccine, 2012, 30(12):2212-2219.

    [2]LI H M, WANG J Q, WANG R, et al. Hepatitis B virus genotypes and genome characteristics in China[J]. World J Gastroenterol, 2015, 21(21): 6684-6697.

    [3]ZEHENDER G, EBRANATI E, GABANELLI E, et al. Enigmatic origin of hepatitis B virus: an ancient travelling companion or a recent encounter?[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(24):7622-7634.

    [4]ARAUZ-RUIZ P, NORDER H, ROBERTSON B H, et al. Genotype H: a new Amerindian genotype of hepatitis B virus revealed in Central America[J]. J Gen Virol, 2002, 83(Pt 8): 2059-2073.

    [5]MAGNIUS L O, NORDER H. Subtypes,genotypes and molecular epidemiology of the hepatitis B virus as reflected by sequence variability of the S-gene[J]. Intervirology, 1995, 38(1-2): 24-34.

    [6]NORDER H, COUROUCé A M, COURSAGET P, et al. Genetic diversity of hepatitis B virus strains derived worldwide: genotypes, subgenotypes,and HBsAg subtypes[J]. Intervirology, 2004, 47(6): 289-309.

    [7]ALEXOPOULOU A, DOURAKIS S P. Genetic heterogeneity of hepatitis viruses and its clinical significance [J]. Curr Drug Targets Inflamm Allergy,2005, 4(1): 47-55.

    [8]AKUTA N, KUMADA H. Influence of hepatitis B virus genotypes on the response to antiviral therapies[J]. J Antimicrob Chemother, 2005, 55(2):139-142.

    [9]IOANNOU G N. Chronic hepatitis B infection:a global disease requiring global strategies[J].Hepatology, 2013, 58(3): 839-843.

    [10]BLUMBERG B S, GERSTLEY B J,HUNGERFORD D A, et al. A serum antigen(Australia antigen) in Down's syndrome,leukemia, and hepatitis[J]. Ann Intern Med,1967, 66(5): 924-931.

    [11]BLUMBERG B S. Primary and secondary prevention of liver cancer caused by HBV[J]. Front Biosci(Schol Ed) 2010, 2: 756-763.

    [12]VAN DAMME P, ZANETTI A R, SHOUVAL D,et al. Strategies for global prevention of hepatitis B virus infection[J]. Adv Exp Med Biol, 2010, 659:175-188.

    [13]OKAMOTO H, TSUDA F, SAKUGAWA H, et al.Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen subtypes[J].J Gen Virol, 1988, 69(Pt 10): 2575-2583.

    [14]NORDER H, COUROUCé A M, MAGNIUS L O. Complete genomes, phylogenetic relatedness,and structural proteins of six strains of the hepatitis B virus, four of which represent two new genotypes[J].Virology, 1994, 198(2): 489-503.

    [15]STUYVER L, DE GENDT S, VAN GEYT C,et al. A new genotype of hepatitis B virus: complete genome and phylogenetic relatedness[J]. J Gen Virol, 2000, 81(Pt 1): 67-74.

    [16]WU F, WU M J, ZHUGE X L, et al. Correlation of the occurrence of YMDD mutations with HBV genotypes, HBV-DNA levels, and HBeAg status in Chinese patients with chronic hepatitis B during lamivudine treatment[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2012, 11(2): 172-176.

    [17]YU H, YUAN Q, GE S X, et al. Molecular and phylogenetic analyses suggest an additional hepatitis B virus genotype “Ⅰ”[J]. PLoS One, 2010, 5(2): e9297.

    [18]TATEMATSU K, TANAKA Y, KURBANOV F,et al. A genetic variant of hepatitis B virus divergent from know human and ape genotypes isolated from a Japanese patient and provisionally assigned to new genotype J[J]. J Virol, 2009, 83(20): 10538-10547.

    [19]OHBA K, MIZOKAMI M, OHNO T, et al.Relationships between serotypes and genotypes of hepatitis B virus: genetic classification of HBV by use of surface genes[J]. Virus Res, 1995, 39(1): 25-34.

    [20]POURKARIM M R, AMINI-BAVIL-OLYAEE S,KURBANOV F, et al. Molecular identification of hepatitis B virus genotypes/subgenotypes: revised classification hurdles and updated resolutions[J].World J Gastroenterol, 2014, 20(23): 7152-7168.

    [21]KAO J H, CHEN P J, LAI M Y, et al. Clinical and virological aspects of blood donors infected with hepatitis B virus genotypes B and C[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(1): 22-25.

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