CAP認(rèn)可要求下SYSMEX XN-9000血液分析儀測定網(wǎng)織紅細(xì)胞及其參數(shù)的性能驗(yàn)證與干擾因素研究

蔣浩琴，顧劍飛，陳 健，王 吉，王凱俊，呂 元

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，上海 200040）

網(wǎng)織紅細(xì)胞（reticulocyte，RET）計(jì)數(shù)用于評估骨髓中紅系增生活躍度已在臨床上使用多年，在血液學(xué)檢驗(yàn)中常使用新亞甲藍(lán)（new methylene blue，NMB）染色的手工目視計(jì)數(shù)法。近年來，新一代采用流式細(xì)胞術(shù)原理檢測RET的血液分析儀，能快速、準(zhǔn)確地檢測RET，并能提供更多RET特異性熒光參數(shù)，特別是未成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞指數(shù)（immature reticulocyte fraction，IRF），已成為骨髓和造血干細(xì)胞移植及化療后骨髓再生的早期標(biāo)志物[1-3]。有研究結(jié)果表明，與RNA結(jié)合使RET發(fā)出熒光的染料可能會對RET檢測造成干擾，如使用某些藥物或存在某些病理狀態(tài)可能導(dǎo)致信號終止或自發(fā)熒光[1，4]。正式應(yīng)用于臨床前，我們對SYSMEX XN-9000血液分析儀檢測RET及其熒光參數(shù)的精密度、攜帶污染率、可比性、線性范圍、準(zhǔn)確度、干擾因素等[5-6]進(jìn)行了嚴(yán)格的方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

SYSMEX XN-9000全自動血液分析儀和配套試劑、配套質(zhì)控品（日本Sysmex公司），尼康雙目顯微鏡（日本尼康公司），NMB染色劑（珠海BASO公司）。

1.2 定義

美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）和國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會（the International Council for Standardization in Haematology，ICSH）的H44-A2 指導(dǎo)文件關(guān)于RET的定義[6]：介于有核紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞中間的紅細(xì)胞，當(dāng)被活體染色劑（如NMB）染色時，含能被染色的核酸（細(xì)胞內(nèi)RNA）或與特定的核酸結(jié)合且被熒光劑染色時，顯示細(xì)胞內(nèi)增高的熒光強(qiáng)度。需注意的是，采用顯微鏡檢查RET時，細(xì)胞必須含有2個或2個以上深藍(lán)色的顆粒（NMB-RET），并且清晰可見，無需顯微鏡對單個細(xì)胞特別聚焦調(diào)整即能發(fā)現(xiàn)其存在，這些顆粒應(yīng)遠(yuǎn)離細(xì)胞邊緣，避免與Heinz小體相混。

1.3 標(biāo)本收集

用真空采血管（美國BD公司）采集乙二胺四乙酸二鉀為抗凝劑的靜脈血標(biāo)本2 mL，采集對象為無任何基礎(chǔ)疾病的體檢人群，除參考區(qū)間驗(yàn)證外，其他用于方法學(xué)驗(yàn)證的采集對象為復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院門診和住院患者。除穩(wěn)定性試驗(yàn)外，其余檢測均在標(biāo)本采集4 h內(nèi)完成。

1.4 儀器校準(zhǔn)

方法學(xué)評估前，儀器已完成半年1次的校準(zhǔn)和校準(zhǔn)驗(yàn)證，校準(zhǔn)精密度要求為變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）＜2%[6]。

1.5 精密度驗(yàn)證

1.5.1 批內(nèi)精密度 選擇網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)絕對值（reticulocyte absolute value，RET#）低值（＜10×109/L）、中值[（10～60）×109/L]、高值（＞200×109/L）[6]的靜脈抗凝血各5份，每份連續(xù)測定11次，棄第1次結(jié)果，各自計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差（s）和CV[7]。網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比（reticulocyte percentage，RET%）和RET#的批內(nèi)精密度要求CV≤5%[6]，熒光參數(shù)的批內(nèi)精密度要求CV≤7.5%。

1.5.2 天間精密度 取近期連續(xù)2個批號的質(zhì)控品，每個批號包括高、中、低值3個水平RET質(zhì)控品，每天同一時間（±30 min以內(nèi)）進(jìn)行操作，連續(xù)觀察20 d，計(jì)算s和CV值。Sysmex在線質(zhì)控：計(jì)算組內(nèi)所有儀器s的平均s值，然后判斷每個儀器的s與平均s的比值即PI，以PI來反映各儀器精密度。

1.6 攜帶污染試驗(yàn)

選擇紅細(xì)胞計(jì)數(shù)高值（＞6.0×1012/L）和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)低值（＜2.0×1012/L）的標(biāo)本進(jìn)行紅細(xì)胞攜帶污染試驗(yàn)，并選擇RET#的高值（＞200×109/L）和低值（＜10×109/L）標(biāo)本進(jìn)行RET%和RET#攜帶污染試驗(yàn)。高值連續(xù)測3次，低值連續(xù)測3次。攜帶污染率（%）=（j1-j3）×100/（i3-j3）。式中i、j3分別是高值第一次、第3次的測定結(jié)果，i3是低值第3次的測定結(jié)果[6]。要求攜帶污染率＜2%[8-9]。

1.7 相關(guān)性比對分析（NMB染色目視計(jì)數(shù)法）

1.7.1 標(biāo)本收集 常規(guī)驗(yàn)證至少檢測40份標(biāo)本[10]，但完整的驗(yàn)證應(yīng)至少檢測250～300份標(biāo)本[7]，其中50%代表正常范圍標(biāo)本，50%代表異常范圍標(biāo)本（25%升高，25%降低）[6-7]。

1.7.2 染色與涂片準(zhǔn)備 標(biāo)本采集后2 h內(nèi)進(jìn)行NMB染色，然后制作至少2張血涂片，涂片要薄而均勻，紅細(xì)胞不能重疊。染色良好的涂片中可見嗜多色性略帶藍(lán)色紅細(xì)胞，其中可以看到深藍(lán)色的顆粒或網(wǎng)狀物質(zhì)為RET[6，11]。

1.7.3 計(jì)數(shù)程序 手工NMB染色法鏡檢至少2 000個紅細(xì)胞（每張血涂片至少1 000個紅細(xì)胞），由2位從事臨檢專業(yè)的中級職稱或高年資檢驗(yàn)技師（至少從事血液專業(yè)10年以上）對至少2張涂片分別進(jìn)行顯微鏡計(jì)數(shù)，取均值（x）作為手工鏡檢的RET%結(jié)果[6，11]。以手工鏡檢結(jié)果為靶值，將SYSMEX XN-9000血液分析儀檢測的RET%結(jié)果（儀器做2次檢測，取x ）與NMB活體染色顯微鏡計(jì)數(shù)x 結(jié)果進(jìn)行比對。

1.8 線性范圍驗(yàn)證

選擇分析測量范圍從最低到最高的各種稀釋度，廠商提供線性范圍為RET%（0%～30%）、RET#（0～720×109/L），用RET極低值標(biāo)本將接近預(yù)期上限的RET高值標(biāo)本分別作100%、80%、60%、40%、20%、10%稀釋，每個稀釋濃度重復(fù)測定3次，計(jì)算[6，8]。

1.9 準(zhǔn)確度確定

手工法與儀器法比對及參加室間質(zhì)評：以參考方法（NMB染色目視計(jì)數(shù)法）測定RET，每年參加美國病理家協(xié)會（the College of American Pathologists，CAP）RET室間質(zhì)評（手工法）2次，已連續(xù)參加11年，合格率100%，以手工法檢測RET%結(jié)果為靶值，取至少40份標(biāo)本（含高、中、低值）進(jìn)行儀器法與手工法比對，通過一致性檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)符合率、確定準(zhǔn)確度（≥90%）。

1.1 0 正常參考區(qū)間驗(yàn)證

根據(jù)廠商提供的參考區(qū)間進(jìn)行驗(yàn)證，首次驗(yàn)證應(yīng)包括至少40份無基礎(chǔ)疾病的體檢標(biāo)本（20名男性和20名女性），符合率＞90%為驗(yàn)證通過。驗(yàn)證不通過的參數(shù)需建立相應(yīng)的參考區(qū)間，至少120名男性和120名女性，每組應(yīng)計(jì)算、s和95%可信區(qū)間，按照Dixon法刪除可能存在的離群值，若組內(nèi)數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，則參考區(qū)間為1.96s，表示95%的可信區(qū)間分布；若數(shù)據(jù)不呈正態(tài)分布，則用百分位數(shù)法（P25和P97.5）確定參考區(qū)間[12]。

1.1 1 敏感性驗(yàn)證

選擇一個正?；蜻m度升高的標(biāo)本（H），RET計(jì)數(shù)（約150×109/L），再選擇1例RET計(jì)數(shù)最低（L）可接受（約5×109/L）的標(biāo)本，不要使用冷凝集標(biāo)本，在骨髓活性最低點(diǎn)的骨髓移植后標(biāo)本為最優(yōu)，其RET計(jì)數(shù)約為 0.1% 或更低。要求同線性驗(yàn)證要求[6]。

1.1 2 干擾評估

收集至少300份靜脈血標(biāo)本，覆蓋各種影響因素和不同疾病種類，對可能存在的不同干擾因素進(jìn)行分組并逐一進(jìn)行一致性符合率分析，對不符合的病例進(jìn)一步進(jìn)行干擾研究。干擾因素主要有各種貧血，血小板增多癥，紅細(xì)胞增多癥，淋巴細(xì)胞增多癥，冷凝集，紅細(xì)胞碎片，有核紅細(xì)胞，傳染性疾病如瘧原蟲感染，服用熒光類藥物，RET%或RET#異常增高或降低，有異常RET、紅細(xì)胞、血小板散點(diǎn)圖和報警提示等[6]。

1.1 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用美國Stata 10統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。相關(guān)性比對、線性、敏感性驗(yàn)證采用相關(guān)性分析[6，8]，計(jì)算線性回歸方程Y?=αX+b；相關(guān)性比對采用配對t檢驗(yàn)，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并進(jìn)行Bland-Altman一致性檢驗(yàn)[7]。采用準(zhǔn)確性和干擾研究判斷一致性符合率，即計(jì)算手工法CV和儀器法CV，然后計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)誤（SEp），符合率應(yīng)≥90%，具體結(jié)果見表1。手工法CV計(jì)算公式為VarR=（pR×qR）/nR，式中VarR為手工法CV、pR為手工法RET%、qR=1－pR、nR為手工法紅細(xì)胞總數(shù)；儀器法CV計(jì)算公式為VarFC=（pFC×qFC）/nFC，式中VarFC為儀器法CV、pFC為儀器法RET%、qFC=1－pFC、nFC為儀器

2 結(jié)果

2.1 批內(nèi)和天間精密度

高、中、低值標(biāo)本RET%、RET#、IRF、低熒光強(qiáng)度網(wǎng)織紅細(xì)胞比率（low fluorescence reticulocyte，LFR）、中熒光強(qiáng)度網(wǎng)織紅細(xì)胞比率（medium fluorescence reticulocyte，MFR）、高熒光強(qiáng)度網(wǎng)織紅細(xì)胞比率（high fluorescence reticulocyte，HFR）的批內(nèi)和天間精密度均符合要求。

2.2 攜帶污染率

RET%為0.29%，RET#為0.38%，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)絕對值為0.22%，均符合攜帶污染率要求。

2.3 相關(guān)性比對

手工法和儀器法檢測400份靜脈血標(biāo)本的相關(guān)性比對呈線性相關(guān)（r2=0.972 4），線性回歸方程式為Y?=0.950 7X+0.160 8（圖1）。配對t檢驗(yàn)，P=0.006 8；Bland-Altman一致性檢驗(yàn)（圖1），P=0.068，2種方法檢測RET%結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 線性范圍驗(yàn)證

RET%的直線相關(guān)回歸分析Y?=1.004 5X+0.195 8（r2=0.998 8），RET#（×109/L）的直線相關(guān)回歸分析，Y?=1.020 9X+3.184 5（r2=0.993 9）。

表1 準(zhǔn)確度評估表

圖1 手工法與儀器法RET%結(jié)果比對

圖2 儀器法檢測RET%線性范圍驗(yàn)證

2.5 準(zhǔn)確度確定

手工法與儀器法的驗(yàn)證結(jié)果根據(jù)準(zhǔn)確度評估表（表1），統(tǒng)計(jì)一致性符合率為91.7 %。Sysmex在線質(zhì)控系統(tǒng)（Sysmex network communication system，SNCS）在線質(zhì)控評估對RET及其參數(shù)的準(zhǔn)確度評價全部合格。參加上海市臨床檢驗(yàn)中心RET（儀器法）室間質(zhì)評，各項(xiàng)參數(shù)結(jié)果均合格。已參加CAP室間質(zhì)評RET RT系列（手工法）連續(xù)11年，成績?nèi)亢细瘛?/p>

2.6 參考區(qū)間確立

根據(jù)對廠商RET%和RET#的參考區(qū)間驗(yàn)證，符合率均≥90%，通過驗(yàn)證。其他RET參數(shù)的廠商范圍未通過驗(yàn)證，因此建立了實(shí)驗(yàn)室自己的范圍。IRF、LFR、MFR呈正態(tài)分布（P＞0.05），HFR呈偏態(tài)分布（p＜0.05）。見表2。

表2 RET參考區(qū)間驗(yàn)證與自建范圍建立

2.7 RET%和RET#敏感性驗(yàn)證

RET%敏感性的直線相關(guān)回歸方程為Y?=1.115 4X-0.081 4（r2=0.993 8）。（2）RET#（×109/L）敏感性直線相關(guān)回歸方程為Y?=1.040 9X-1.075 9（r2=0.983 1）。

2.8 干擾評估

508例病例分析中，我們發(fā)現(xiàn)瘧原蟲和熒光類藥物等影響因素對RET結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，引起RET%假性增高，并且嚴(yán)重干擾的病例都出現(xiàn)RET異常散點(diǎn)圖報警提示，瘧原蟲病例中還出現(xiàn)了瘧原蟲感染的報警信息。2例瘧原蟲病例中，例1患者為惡性瘧感染者，外周血涂片紅細(xì)胞感染率為20%，以大量環(huán)狀體和少量裂殖體為主，治療前儀器法RET%為8.5%，手工法RET%僅0.5%，治療后儀器法RET%結(jié)果逐漸下降，完全治愈后與手工法結(jié)果一致。例2患者為惡性瘧感染者，外周血涂片紅細(xì)胞感染率為1%，以少量配子體和環(huán)狀體為主，治療前儀器法RET%為4.6%，手工法RET%為3.9%，略有干擾，治愈后與手工法結(jié)果一致。疑似熒光藥物干擾病例中，儀器法RET%為16.7%，手工法RET%僅0.9%，同一病例連續(xù)追蹤數(shù)次，結(jié)果均類似，排除其他干擾因素后，病史顯示患者先后服用過10余種抗菌藥物和可疑熒光藥物。

在引起RET%假性增高的影響因素分組統(tǒng)計(jì)中，除瘧原蟲和熒光類藥物嚴(yán)重干擾RET結(jié)果外，紅細(xì)胞、血小板增多，紅細(xì)胞碎片、有核紅細(xì)胞等干擾因素的存在均能導(dǎo)致RET計(jì)數(shù)結(jié)果的假性增高（p＜0.05）。引起RET%假性增高的干擾因素分別為有核紅細(xì)胞（18.5%）、紅細(xì)胞增多癥（13.3%）、淋巴細(xì)胞增多癥（12.8%）、血小板增多癥（10.5%）、紅細(xì)胞凝集/冷凝集（9.5%）、Howell-Jolly小體（7.7%）、白細(xì)胞增多癥（6.7%）、血小板聚集（5.9%）、巨大血小板（5.6%）和紅細(xì)胞碎片（2.9%），其他如嗜堿性點(diǎn)彩紅細(xì)胞、帕彭海默小體等也會影響RET計(jì)數(shù)的結(jié)果。這些影響因素的干擾程度取決于干擾物的濃度和/或數(shù)量。

3 討論

RET及其參數(shù)在臨床的應(yīng)用特別是對骨髓造血功能的評估和監(jiān)測非常重要。本研究發(fā)現(xiàn)SYSMEX XN-9000血液分析儀對RET及其參數(shù)的檢測性能良好，但在臨床應(yīng)用中仍需結(jié)合病史、儀器報警信息和血涂片鏡檢等及時發(fā)現(xiàn)和糾正可能存在的干擾。

在臨床工作中，我們可以通過觀察儀器的狀態(tài)是否正常（如吸樣問題）、Flag直方圖、異常散點(diǎn)圖或報警提示（尤其是瘧原蟲感染報警和RET異常散點(diǎn)圖報警，后者在嚴(yán)重干擾病例中均有出現(xiàn)）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度異常增高（＞360 g/L常提示可能存在冷凝集現(xiàn)象[2]，可37 ℃孵育或采用XN系列RET通道的紅細(xì)胞-O參數(shù)來及時糾正RET#的計(jì)數(shù)）、血涂片染色顯微鏡檢查、結(jié)合病史或歷史結(jié)果核查等發(fā)現(xiàn)可能存在的干擾，并且用儀器自動復(fù)檢、手工法復(fù)查等方法進(jìn)行及時的糾正，以保證RET檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。

目前，系統(tǒng)評估和報告流式細(xì)胞術(shù)檢測RET的完整方法學(xué)評估，包括對干擾因素的研究，國內(nèi)外研究均較少。CAP最新checklist條款中對于儀器法檢測RET提出了明確的要求，開展前需要評估干擾因素。對儀器的方法學(xué)評估既保證了RET檢測結(jié)果的可靠性，又能指導(dǎo)如何去發(fā)現(xiàn)和及時糾正可能存在的干擾。本研究中準(zhǔn)確性和干擾因素病例研究既覆蓋了臨床實(shí)際檢測RET計(jì)數(shù)的全線性范圍，還包括了超線性濃度水平，也包含了一些異常細(xì)胞或其他可能干擾RET計(jì)數(shù)的血液成分或疾病，如大量的Howell-Jolly小體、瘧原蟲感染、淋巴細(xì)胞增多癥、血小板增多癥或紅細(xì)胞增多癥、血小板聚集、嗜堿性點(diǎn)彩紅細(xì)胞、大血小板、紅細(xì)胞碎片、有核紅細(xì)胞、帕彭海默小體、自發(fā)熒光類藥物、冷凝集等，其中瘧原蟲感染病例中，由于感染的紅細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀體含RNA物質(zhì)，因此外周血中大量環(huán)狀體的存在對RET檢測影響較大，而配子體等相對影響較小，并且對RET檢測的干擾程度也取決于紅細(xì)胞內(nèi)的感染程度和狀態(tài)。由于本研究中瘧原蟲病例較少，分析可能有一定的局限性。

另有文獻(xiàn)報道如使用某些藥物可能導(dǎo)致熒光信號終止（如蒽環(huán)類藥物）或某些病理狀態(tài)（如巴貝西蟲等其他胞內(nèi)寄生蟲感染、卟啉癥、Heinz小體、異常紅細(xì)胞等）均會干擾RET的檢測結(jié)果[1，6]。由于全自動血液分析儀檢測RET可能的干擾因素眾多，本研究未能對覆蓋全部的干擾因素作一一研究，在后續(xù)臨床實(shí)踐中我們將持續(xù)跟蹤研究，包括對已知重要干擾因素增加病例繼續(xù)研究和分析，為臨床疾病診斷和檢測提供更可靠的數(shù)據(jù)和信息。

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