抗核抗體與EB病毒抗體水平的關(guān)系

張敏杰， 高玉芳

（咸陽(yáng)市中心醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000）

EB病毒 （Epstein-Barr virus，EBV）是一種普遍存在的γ-皰疹病毒，世界范圍內(nèi)有＞90%的人被其感染，其通過(guò)在B細(xì)胞內(nèi)表達(dá)限定數(shù)量的病毒抗原而實(shí)現(xiàn)潛伏性感染。EBV急性感染可導(dǎo)致50%的年輕人出現(xiàn)傳染性單核細(xì)胞增多癥（infectious mononucleosis，IM），并出現(xiàn)大量的病毒復(fù)制。據(jù)推測(cè)，IM患者發(fā)展成為多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）和其他自身免疫性疾?。╝utoimmune disease，AID）的風(fēng)險(xiǎn)增加了20倍[1]。因?yàn)镋BV感染引起的IM發(fā)生區(qū)域與MS的患病區(qū)域有相似之處，所以IM患者更易患MS。對(duì)MS患者體內(nèi)的EBV特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MS患者血清中EBV核抗原（EBV nuclear antigen，EBNA-1）IgG水平明顯升高[2]。國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者體內(nèi)EBNA-1 IgA和EBV-衣殼抗原（virus capsid antigen，VCA）IgA滴度升高，EBV-早期抗原（early antigen，EA）/D IgA的陽(yáng)性率為58%，然而健康對(duì)照者血清EBVEA/D IgA檢測(cè)呈陰性[3]。雖然EBV與淋巴瘤形成之間的關(guān)系日益明確[4]，但其在自身免疫性反應(yīng)中的作用尚不明了。這些EBV相關(guān)的AID可能是由具有不同遺傳背景的人體內(nèi)EBV的免疫調(diào)節(jié)能力發(fā)生改變引起的。本研究通過(guò)對(duì)比分析抗核抗體（anti-nuclear antibody，ANA）、抗可提取性核抗原（extractable nuclear antigen，ENA）抗體與EBV抗體水平的關(guān)系，探討EBV感染狀態(tài)對(duì)自身抗原免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的作用。

1 材料和方法

1.1 樣本來(lái)源

80例樣本均來(lái)自2015年12月—2017年2月咸陽(yáng)市中心醫(yī)院門(mén)診就診或住院采用間接免疫熒光法檢測(cè)ANA為陽(yáng)性的患者，其中男8例、女72例，年齡（50.4±17.7）歲。80例樣本中抗ENA抗體陽(yáng)性樣本74例。分離血清，置-70 ℃保存待測(cè)。以體檢中心的48名體檢健康者為健康對(duì)照組，其中男5名、女43名，年齡（48.9±18.5）歲，無(wú)自身免疫性疾病及家族史，ANA和抗ENA抗體均為陰性。

1.2 ANA的檢測(cè)

采用間接免疫熒光法檢測(cè)ANA，試劑盒來(lái)源于德國(guó)歐蒙公司。每個(gè)反應(yīng)區(qū)同時(shí)有Hep-2細(xì)胞系和猴肝組織2種抗原基質(zhì)，Hep-2細(xì)胞及猴肝組織均無(wú)特異性熒光為陰性，Hep-2細(xì)胞及猴肝組織產(chǎn)生明顯特異性熒光為陽(yáng)性。根據(jù)熒光模式對(duì)ANA進(jìn)行分型，熒光較暗、核型不易區(qū)分者為弱陽(yáng)性。

1.3 抗ENA抗體譜的檢測(cè)

采用免疫印跡法體外定性檢測(cè)血清或血漿中的人抗nRNP/Sm、Sm、SS-A/Ro、SS-A/Ro-52、SS-B/La、Scl-70、Jo-1、CENP B、ds-DNA、核小體、組蛋白、核糖體P蛋白12種不同抗原IgG類(lèi)抗體，試劑盒由德國(guó)歐蒙公司提供，結(jié)果在歐蒙公司提供的軟件上進(jìn)行分析。臨界值計(jì)為陰性。操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 抗EBV抗體的檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)EBVVCA IgM、EBV-VCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG，試劑盒由德國(guó)歐蒙公司提供。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用ELx800酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）在450 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色，測(cè)定每個(gè)孔的吸光度（A）值。通過(guò)計(jì)算患者樣本或?qū)φ昭錋值與標(biāo)準(zhǔn)品A值的比值定性判斷EBV-VCA IgM結(jié)果，比值≥1.1為陽(yáng)性。EBV-VCA IgG、EBVEA IgG和EBNA-1 IgG以3份標(biāo)準(zhǔn)血清的濃度和A值分別為橫、縱坐標(biāo)點(diǎn)對(duì)點(diǎn)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出血清中抗體的濃度。對(duì)A值超出標(biāo)準(zhǔn)品1（200 RU/mL）的樣本進(jìn)行1∶400稀釋后重新測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出的數(shù)據(jù)乘以4即為樣本中抗體的濃度。以EBVVCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG≥22 RU/mL為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。抗EBV抗體陽(yáng)性率的比較采用Pearson χ2檢驗(yàn)。定量資料呈偏態(tài)分布，用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]描述，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANA陽(yáng)性患者與健康對(duì)照者血清抗EBV抗體水平的比較

ANA陽(yáng)性組血清EBV-VCA IgM陽(yáng)性4例（5.00%），EBV-VCA IgG陽(yáng)性80例（100.00%），EBV-EA IgG陽(yáng)性25例（31.25%），EBNA-1 IgG陽(yáng)性80例（100.00%）。健康對(duì)照組血清未見(jiàn)EBVVCA IgM陽(yáng)性反應(yīng)，EBV-VCA IgG陽(yáng)性47例（97.92%）；EBV-EA IgG陽(yáng)性6例（12.50%），EBNA-1 IgG陽(yáng)性45例（93.75%）。ANA陽(yáng)性組EBV-EA IgG陽(yáng)性率明顯高于健康對(duì)照組（χ2=5.747，P=0.017）。ANA陽(yáng)性組血清EBVVCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG水平較健康對(duì)照組明顯升高（Z值分別為-5.59、-2.64、-4.52，p＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 ANA陽(yáng)性組和健康對(duì)照組血清抗EBV抗體水平的比較 [RU/mL，M（P25，P75）]

2.2 抗ENA抗體陽(yáng)性組與陰性組抗EBV抗體水平的比較

在抗ENA抗體譜中，抗SS-A/Ro抗體、抗SS-B/La抗體陽(yáng)性組分別與抗SS-A/Ro抗體、抗SS-B/La抗體陰性組比較EBNA-1 IgG水平明顯升高（Z=-2.630，P=0.008；Z=-2.515，P=0.011），EBV-VCA IgG 和EBV-EA IgG水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。抗核小體抗體陽(yáng)性組與抗核小體抗體陰性組比較EBV-VCA IgG、EBV-EA IgG水平明顯升高（Z=-2.355，P=0.018；Z=-2.017，P=0.043），但2組之間EBNA-1 IgG水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？笴ENP B抗體陽(yáng)性組與抗CENP B抗體陰性組比較EBNA-1 IgG水平明顯降低（Z=-2.25，P=0.024）。見(jiàn)表2。

表2 抗ENA抗體陽(yáng)性組與陰性組抗EBV抗體水平的比較 [RU/mL ，M（P25，P75）]

2.3 ANA陽(yáng)性患者抗ENA抗體陽(yáng)性個(gè)數(shù)與抗EBV抗體水平的關(guān)系

抗ENA抗體譜中自身抗體陽(yáng)性個(gè)數(shù)不同的ANA陽(yáng)性患者EBV-EA IgG水平不同（χ2=11.380，P=0.023），從抗ENA抗體陰性到自身抗體陽(yáng)性個(gè)數(shù)≥4，ANA陽(yáng)性患者血清EBV-EA IgG水平升高。但自身抗體陽(yáng)性個(gè)數(shù)為2個(gè)和自身抗體陽(yáng)性個(gè)數(shù)為3個(gè)的患者，EBVEA IgG水平分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.65，P=0.100）?？笶NA抗體譜中自身抗體陽(yáng)性個(gè)數(shù)不同的患者EBV-VCA IgG和EBNA-1 IgG水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 抗ENA抗體陽(yáng)性個(gè)數(shù)與抗EBV抗體水平 [RU/mL，M（P25，P75）]

3 討論

現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，EBV具備在活動(dòng)性的裂解復(fù)制感染周期與潛伏狀態(tài)之間相互轉(zhuǎn)變的能力[5]。在原發(fā)感染期，宿主細(xì)胞內(nèi)的EBV是以裂解復(fù)制感染周期的方式存在，EBV裂解周期抗原EBV-EA/D既可位于受感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，也可存在于細(xì)胞核內(nèi)，其與病毒DNA聚合酶所處的位置相同，對(duì)病毒基因的復(fù)制非常重要。原發(fā)性EBV感染急性期EBV-VCA IgG通常到達(dá)峰值較遲，并且衰退較慢，急性期以后EBV-VCA IgG能夠以相對(duì)穩(wěn)定的滴度持續(xù)存在。原發(fā)感染后，EBV通常進(jìn)入潛伏期，為了逃避宿主細(xì)胞的免疫殺傷，僅表達(dá)少量的基因產(chǎn)物。這一時(shí)期EBNA-1充當(dāng)著復(fù)制因子的角色。因此，EBNA-1 IgG的存在排除了急性感染情況，提示感染處于既往感染期。一旦EBV由潛伏感染進(jìn)入到裂解復(fù)制感染周期時(shí)，EBV-EA/D是其表達(dá)的第1個(gè)抗原，并且EBV-EA/D是免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用的明確目標(biāo)。

本研究通過(guò)比較ANA陽(yáng)性患者與ANA陰性健康對(duì)照者血清抗EBV抗體水平，發(fā)現(xiàn)EBV-VCA IgM的陽(yáng)性率在ANA陽(yáng)性患者與健康對(duì)照者間并沒(méi)有明顯差異，但ANA陽(yáng)性患者血清EBV-EA IgG陽(yáng)性率明顯高于健康對(duì)照者（p＜0.017）。同時(shí)，ANA陽(yáng)性患者血清EBVVCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG水平比健康對(duì)照者明顯升高（p＜0.01）。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果[6]相符。EBV-EA/D在EBV裂解復(fù)制感染周期中對(duì)病毒基因復(fù)制起到重要的作用，推測(cè)可能是EBV復(fù)發(fā)感染或慢性反復(fù)持續(xù)感染導(dǎo)致患者ANA出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)之故。但EBV復(fù)發(fā)感染或慢性持續(xù)感染為何會(huì)導(dǎo)致ANA出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，HARLEY等[7]研究發(fā)現(xiàn)，狼瘡抗體的產(chǎn)生源于抗EBNA-1抗體的體液免疫應(yīng)答，EBNA-1抗原表位傳播導(dǎo)致抗SSA/Ro抗體和抗SmB抗體產(chǎn)生。另有研究結(jié)果表明，SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中出現(xiàn)EBNA-1和潛伏膜蛋白1的表達(dá)增加[8]。如果原發(fā)性EBV感染急性期或復(fù)發(fā)感染是SLE發(fā)病的重要機(jī)制，那么Harley等的研究結(jié)果則與這一假設(shè)不謀而合。有研究結(jié)果表明，抗ds-DNA抗體是SLE患者的特異性標(biāo)志抗體，是診斷及判斷SLE患者疾病活動(dòng)性的重要指標(biāo)之一[9]。某些臨床診斷為混合性結(jié)締組織病和系統(tǒng)硬化癥的患者也檢出抗ds-DNA抗體陽(yáng)性，可能與患者全身結(jié)締組織受累有關(guān)。佟大偉等[10]用間接免疫熒光法、ELISA及放射免疫法檢測(cè)抗ds-DNA抗體，120例SLE患者3種方法檢出抗ds-DNA抗體陽(yáng)性率分別為25%、32%和32%。楊林等[11]用ELISA、免疫印跡法及間接免疫熒光法檢測(cè)98例AID（類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、未分化結(jié)締組織病、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、系統(tǒng)性硬化癥、原發(fā)性干燥綜合征等）患者抗ds-DNA抗體的陽(yáng)性率分別為11.9%、7.1%和5.1%。本研究80例ANA陽(yáng)性患者并未確診是否為SLE患者或其他AID患者，抗ds-DNA抗體陽(yáng)性率為11.25%（9/80）?？筪s-DNA抗體陽(yáng)性組與抗ds-DNA抗體陰性組比較EBV-VCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG均無(wú)差異。但9例抗ds-DNA抗體陽(yáng)性組EBNA-1 IgG水平[183.30（134.06，312.63）RU/mL]高于71例抗ds-DNA抗體陰性組[160.40（94.30，481.33）RU/mL]。由于抗ds-DNA抗體與SLE密切相關(guān)，因此EBV潛伏感染產(chǎn)物EBNA-1 IgG水平升高可能誘發(fā)SLE。然而，這需要加大抗ds-DNA抗體陽(yáng)性樣本量以進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

EBV具有嗜B淋巴細(xì)胞的特性，大多數(shù)EBV感染者處于潛伏狀態(tài)，EBNA-1為其潛伏感染狀態(tài)下的病毒表達(dá)產(chǎn)物。在外界某些因素的刺激下，病毒的潛伏感染狀態(tài)被破壞，病毒進(jìn)入裂解復(fù)制感染周期，這一過(guò)程中病毒基因表達(dá)大量病毒產(chǎn)物，促進(jìn)病毒在宿主細(xì)胞中散播，造成宿主免疫系統(tǒng)紊亂。據(jù)報(bào)道SSA/Ro和EBNA-1蛋白具有高度同源性[12]。本研究對(duì)比分析了抗ENA抗體譜中各種自身抗體與抗EBV抗體水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)抗SS-A/Ro抗體陽(yáng)性組與抗SS-A/Ro抗體陰性組比較，抗SS-B/La抗體陽(yáng)性組與抗SS-B/La抗體陰性組比較，EBNA-1 IgG水平均明顯升高（p＜0.05），EBV-VCA IgG和EBV-EA IgG水平未見(jiàn)差異，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果[13]相符。同時(shí)，抗CENP B抗體陽(yáng)性組與抗CENP B抗體陰性組比較，EBNA-1 IgG水平明顯降低（P=0.024），結(jié)果發(fā)現(xiàn)13例抗CENP B抗體陽(yáng)性患者其抗SS-A/Ro抗體基本為陰性。這一結(jié)果印證了EBNA-1與自身抗原SS-A/Ro具有同源性，EBNA-1誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的特異性EBNA-1 IgG抗體反應(yīng)與SS-A/Ro發(fā)生交叉反應(yīng)，從而在AID的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)抗核小體抗體陽(yáng)性組與抗核小體抗體陰性組比較，EBV-VCA IgG、EBV-EA IgG水平明顯升高（p＜0.05）。隨著抗ENA譜中自身抗體個(gè)數(shù)的增多，EBV-EA IgG水平明顯升高（P=0.023）。總之，本研究結(jié)果更進(jìn)一步說(shuō)明了自身抗體與EBV免疫反應(yīng)之間的緊密關(guān)系。然而，需要更大量的同質(zhì)性種群研究來(lái)深入闡述病毒在自身免疫機(jī)制中的作用。

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