張敏杰, 高玉芳
(咸陽市中心醫(yī)院,陜西 咸陽 712000)
EB病毒 (Epstein-Barr virus,EBV)是一種普遍存在的γ-皰疹病毒,世界范圍內(nèi)有>90%的人被其感染,其通過在B細(xì)胞內(nèi)表達(dá)限定數(shù)量的病毒抗原而實現(xiàn)潛伏性感染。EBV急性感染可導(dǎo)致50%的年輕人出現(xiàn)傳染性單核細(xì)胞增多癥(infectious mononucleosis,IM),并出現(xiàn)大量的病毒復(fù)制。據(jù)推測,IM患者發(fā)展成為多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)和其他自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID)的風(fēng)險增加了20倍[1]。因為EBV感染引起的IM發(fā)生區(qū)域與MS的患病區(qū)域有相似之處,所以IM患者更易患MS。對MS患者體內(nèi)的EBV特異性抗體進行檢測,發(fā)現(xiàn)MS患者血清中EBV核抗原(EBV nuclear antigen,EBNA-1)IgG水平明顯升高[2]。國外有文獻報道,在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)患者體內(nèi)EBNA-1 IgA和EBV-衣殼抗原(virus capsid antigen,VCA)IgA滴度升高,EBV-早期抗原(early antigen,EA)/D IgA的陽性率為58%,然而健康對照者血清EBVEA/D IgA檢測呈陰性[3]。雖然EBV與淋巴瘤形成之間的關(guān)系日益明確[4],但其在自身免疫性反應(yīng)中的作用尚不明了。這些EBV相關(guān)的AID可能是由具有不同遺傳背景的人體內(nèi)EBV的免疫調(diào)節(jié)能力發(fā)生改變引起的。本研究通過對比分析抗核抗體(anti-nuclear antibody,ANA)、抗可提取性核抗原(extractable nuclear antigen,ENA)抗體與EBV抗體水平的關(guān)系,探討EBV感染狀態(tài)對自身抗原免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的作用。
80例樣本均來自2015年12月—2017年2月咸陽市中心醫(yī)院門診就診或住院采用間接免疫熒光法檢測ANA為陽性的患者,其中男8例、女72例,年齡(50.4±17.7)歲。80例樣本中抗ENA抗體陽性樣本74例。分離血清,置-70 ℃保存待測。以體檢中心的48名體檢健康者為健康對照組,其中男5名、女43名,年齡(48.9±18.5)歲,無自身免疫性疾病及家族史,ANA和抗ENA抗體均為陰性。
采用間接免疫熒光法檢測ANA,試劑盒來源于德國歐蒙公司。每個反應(yīng)區(qū)同時有Hep-2細(xì)胞系和猴肝組織2種抗原基質(zhì),Hep-2細(xì)胞及猴肝組織均無特異性熒光為陰性,Hep-2細(xì)胞及猴肝組織產(chǎn)生明顯特異性熒光為陽性。根據(jù)熒光模式對ANA進行分型,熒光較暗、核型不易區(qū)分者為弱陽性。
采用免疫印跡法體外定性檢測血清或血漿中的人抗nRNP/Sm、Sm、SS-A/Ro、SS-A/Ro-52、SS-B/La、Scl-70、Jo-1、CENP B、ds-DNA、核小體、組蛋白、核糖體P蛋白12種不同抗原IgG類抗體,試劑盒由德國歐蒙公司提供,結(jié)果在歐蒙公司提供的軟件上進行分析。臨界值計為陰性。操作按試劑盒說明書進行。
采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測EBVVCA IgM、EBV-VCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG,試劑盒由德國歐蒙公司提供。按試劑盒說明書進行操作。用ELx800酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)在450 nm波長處進行比色,測定每個孔的吸光度(A)值。通過計算患者樣本或?qū)φ昭錋值與標(biāo)準(zhǔn)品A值的比值定性判斷EBV-VCA IgM結(jié)果,比值≥1.1為陽性。EBV-VCA IgG、EBVEA IgG和EBNA-1 IgG以3份標(biāo)準(zhǔn)血清的濃度和A值分別為橫、縱坐標(biāo)點對點作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線求出血清中抗體的濃度。對A值超出標(biāo)準(zhǔn)品1(200 RU/mL)的樣本進行1∶400稀釋后重新測定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的數(shù)據(jù)乘以4即為樣本中抗體的濃度。以EBVVCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG≥22 RU/mL為陽性。
采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析??笶BV抗體陽性率的比較采用Pearson χ2檢驗。定量資料呈偏態(tài)分布,用中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25,P75)]描述,2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗,多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。以p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
ANA陽性組血清EBV-VCA IgM陽性4例(5.00%),EBV-VCA IgG陽性80例(100.00%),EBV-EA IgG陽性25例(31.25%),EBNA-1 IgG陽性80例(100.00%)。健康對照組血清未見EBVVCA IgM陽性反應(yīng),EBV-VCA IgG陽性47例(97.92%);EBV-EA IgG陽性6例(12.50%),EBNA-1 IgG陽性45例(93.75%)。ANA陽性組EBV-EA IgG陽性率明顯高于健康對照組(χ2=5.747,P=0.017)。ANA陽性組血清EBVVCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG水平較健康對照組明顯升高(Z值分別為-5.59、-2.64、-4.52,p<0.01)。見表1。
表1 ANA陽性組和健康對照組血清抗EBV抗體水平的比較 [RU/mL,M(P25,P75)]
在抗ENA抗體譜中,抗SS-A/Ro抗體、抗SS-B/La抗體陽性組分別與抗SS-A/Ro抗體、抗SS-B/La抗體陰性組比較EBNA-1 IgG水平明顯升高(Z=-2.630,P=0.008;Z=-2.515,P=0.011),EBV-VCA IgG 和EBV-EA IgG水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)??购诵◇w抗體陽性組與抗核小體抗體陰性組比較EBV-VCA IgG、EBV-EA IgG水平明顯升高(Z=-2.355,P=0.018;Z=-2.017,P=0.043),但2組之間EBNA-1 IgG水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)??笴ENP B抗體陽性組與抗CENP B抗體陰性組比較EBNA-1 IgG水平明顯降低(Z=-2.25,P=0.024)。見表2。
表2 抗ENA抗體陽性組與陰性組抗EBV抗體水平的比較 [RU/mL ,M(P25,P75)]
抗ENA抗體譜中自身抗體陽性個數(shù)不同的ANA陽性患者EBV-EA IgG水平不同(χ2=11.380,P=0.023),從抗ENA抗體陰性到自身抗體陽性個數(shù)≥4,ANA陽性患者血清EBV-EA IgG水平升高。但自身抗體陽性個數(shù)為2個和自身抗體陽性個數(shù)為3個的患者,EBVEA IgG水平分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-1.65,P=0.100)??笶NA抗體譜中自身抗體陽性個數(shù)不同的患者EBV-VCA IgG和EBNA-1 IgG水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。
表3 抗ENA抗體陽性個數(shù)與抗EBV抗體水平 [RU/mL,M(P25,P75)]
現(xiàn)有的研究結(jié)果表明,EBV具備在活動性的裂解復(fù)制感染周期與潛伏狀態(tài)之間相互轉(zhuǎn)變的能力[5]。在原發(fā)感染期,宿主細(xì)胞內(nèi)的EBV是以裂解復(fù)制感染周期的方式存在,EBV裂解周期抗原EBV-EA/D既可位于受感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi),也可存在于細(xì)胞核內(nèi),其與病毒DNA聚合酶所處的位置相同,對病毒基因的復(fù)制非常重要。原發(fā)性EBV感染急性期EBV-VCA IgG通常到達(dá)峰值較遲,并且衰退較慢,急性期以后EBV-VCA IgG能夠以相對穩(wěn)定的滴度持續(xù)存在。原發(fā)感染后,EBV通常進入潛伏期,為了逃避宿主細(xì)胞的免疫殺傷,僅表達(dá)少量的基因產(chǎn)物。這一時期EBNA-1充當(dāng)著復(fù)制因子的角色。因此,EBNA-1 IgG的存在排除了急性感染情況,提示感染處于既往感染期。一旦EBV由潛伏感染進入到裂解復(fù)制感染周期時,EBV-EA/D是其表達(dá)的第1個抗原,并且EBV-EA/D是免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用的明確目標(biāo)。
本研究通過比較ANA陽性患者與ANA陰性健康對照者血清抗EBV抗體水平,發(fā)現(xiàn)EBV-VCA IgM的陽性率在ANA陽性患者與健康對照者間并沒有明顯差異,但ANA陽性患者血清EBV-EA IgG陽性率明顯高于健康對照者(p<0.017)。同時,ANA陽性患者血清EBVVCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG水平比健康對照者明顯升高(p<0.01)。本研究結(jié)果與文獻結(jié)果[6]相符。EBV-EA/D在EBV裂解復(fù)制感染周期中對病毒基因復(fù)制起到重要的作用,推測可能是EBV復(fù)發(fā)感染或慢性反復(fù)持續(xù)感染導(dǎo)致患者ANA出現(xiàn)陽性反應(yīng)之故。但EBV復(fù)發(fā)感染或慢性持續(xù)感染為何會導(dǎo)致ANA出現(xiàn)陽性反應(yīng),HARLEY等[7]研究發(fā)現(xiàn),狼瘡抗體的產(chǎn)生源于抗EBNA-1抗體的體液免疫應(yīng)答,EBNA-1抗原表位傳播導(dǎo)致抗SSA/Ro抗體和抗SmB抗體產(chǎn)生。另有研究結(jié)果表明,SLE患者外周血單個核細(xì)胞中出現(xiàn)EBNA-1和潛伏膜蛋白1的表達(dá)增加[8]。如果原發(fā)性EBV感染急性期或復(fù)發(fā)感染是SLE發(fā)病的重要機制,那么Harley等的研究結(jié)果則與這一假設(shè)不謀而合。有研究結(jié)果表明,抗ds-DNA抗體是SLE患者的特異性標(biāo)志抗體,是診斷及判斷SLE患者疾病活動性的重要指標(biāo)之一[9]。某些臨床診斷為混合性結(jié)締組織病和系統(tǒng)硬化癥的患者也檢出抗ds-DNA抗體陽性,可能與患者全身結(jié)締組織受累有關(guān)。佟大偉等[10]用間接免疫熒光法、ELISA及放射免疫法檢測抗ds-DNA抗體,120例SLE患者3種方法檢出抗ds-DNA抗體陽性率分別為25%、32%和32%。楊林等[11]用ELISA、免疫印跡法及間接免疫熒光法檢測98例AID(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、未分化結(jié)締組織病、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、系統(tǒng)性硬化癥、原發(fā)性干燥綜合征等)患者抗ds-DNA抗體的陽性率分別為11.9%、7.1%和5.1%。本研究80例ANA陽性患者并未確診是否為SLE患者或其他AID患者,抗ds-DNA抗體陽性率為11.25%(9/80)??筪s-DNA抗體陽性組與抗ds-DNA抗體陰性組比較EBV-VCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG均無差異。但9例抗ds-DNA抗體陽性組EBNA-1 IgG水平[183.30(134.06,312.63)RU/mL]高于71例抗ds-DNA抗體陰性組[160.40(94.30,481.33)RU/mL]。由于抗ds-DNA抗體與SLE密切相關(guān),因此EBV潛伏感染產(chǎn)物EBNA-1 IgG水平升高可能誘發(fā)SLE。然而,這需要加大抗ds-DNA抗體陽性樣本量以進一步評價。
EBV具有嗜B淋巴細(xì)胞的特性,大多數(shù)EBV感染者處于潛伏狀態(tài),EBNA-1為其潛伏感染狀態(tài)下的病毒表達(dá)產(chǎn)物。在外界某些因素的刺激下,病毒的潛伏感染狀態(tài)被破壞,病毒進入裂解復(fù)制感染周期,這一過程中病毒基因表達(dá)大量病毒產(chǎn)物,促進病毒在宿主細(xì)胞中散播,造成宿主免疫系統(tǒng)紊亂。據(jù)報道SSA/Ro和EBNA-1蛋白具有高度同源性[12]。本研究對比分析了抗ENA抗體譜中各種自身抗體與抗EBV抗體水平的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)抗SS-A/Ro抗體陽性組與抗SS-A/Ro抗體陰性組比較,抗SS-B/La抗體陽性組與抗SS-B/La抗體陰性組比較,EBNA-1 IgG水平均明顯升高(p<0.05),EBV-VCA IgG和EBV-EA IgG水平未見差異,本研究結(jié)果與文獻結(jié)果[13]相符。同時,抗CENP B抗體陽性組與抗CENP B抗體陰性組比較,EBNA-1 IgG水平明顯降低(P=0.024),結(jié)果發(fā)現(xiàn)13例抗CENP B抗體陽性患者其抗SS-A/Ro抗體基本為陰性。這一結(jié)果印證了EBNA-1與自身抗原SS-A/Ro具有同源性,EBNA-1誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的特異性EBNA-1 IgG抗體反應(yīng)與SS-A/Ro發(fā)生交叉反應(yīng),從而在AID的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。此外,本研究發(fā)現(xiàn)抗核小體抗體陽性組與抗核小體抗體陰性組比較,EBV-VCA IgG、EBV-EA IgG水平明顯升高(p<0.05)。隨著抗ENA譜中自身抗體個數(shù)的增多,EBV-EA IgG水平明顯升高(P=0.023)??傊?,本研究結(jié)果更進一步說明了自身抗體與EBV免疫反應(yīng)之間的緊密關(guān)系。然而,需要更大量的同質(zhì)性種群研究來深入闡述病毒在自身免疫機制中的作用。
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