運用CLSI EP7-A2文件評價溶血對血糖檢測的影響

沈建江， 符布清， 趙 春， 徐 天

（江蘇省中醫(yī)院檢驗科，江蘇 南京 210029）

目前，溶血樣本占不合格樣本總量的60%左右，是臨床實驗室退回樣本的主要原因[1-2]。但對一些特殊情況的檢查，如葡萄糖耐量試驗，由于其抽血時間有著嚴(yán)格的規(guī)定，餐后每次樣本都是唯一且不可替代的。雖然現(xiàn)在臨床常用的己糖激酶（hexokinase，HK）法有著良好的抗溶血干擾能力，但一旦溶血程度嚴(yán)重，極有可能造成結(jié)果的不準(zhǔn)確。在美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP7-A2文件中，有2種干擾評價方案（配對差異實驗和劑量效應(yīng)實驗）可供使用。將潛在的干擾物質(zhì)添加至檢測樣本中，評價其相對于未加干擾物質(zhì)的對照組的偏移，即配對差異實驗。若引起的偏移有顯著臨床意義，則為干擾物質(zhì)，應(yīng)進(jìn)一步評價，證實干擾程度與干擾物濃度的關(guān)系，即劑量效應(yīng)實驗。本研究采用CLSI EP7-A2文件中的2種干擾評價方案確定溶血對葡萄糖（glucose，Glu）測定是否有干擾以及溶血達(dá)到什么程度會對結(jié)果產(chǎn)生干擾，進(jìn)而給臨床醫(yī)生提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集江蘇省中醫(yī)院體檢當(dāng)天無黃疸、溶血、脂血的剩余血清樣本，制備成混合血清，Glu濃度高值為11.1 mmol/L、中值為7.0 mmol/L。

1.2 儀器與試劑

AU5800全自動生化分析儀（美國Beckman-Coulter公司）。葡萄糖測定試劑盒（HK法，批號1216071）、校準(zhǔn)品（批號0417021）購自四川邁克生物科技股份有限公司，質(zhì)控品購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。檢測前儀器情況良好，用校準(zhǔn)品校準(zhǔn)Glu項目，并且質(zhì)控在控。

1.3 干擾物貯存液配制[3]

依據(jù)CLSI EP7-A2文件要求，制成100 g/L血紅蛋白（hemoglobin，Hb）貯存液。

1.4 配對差異實驗

1.4.1 樣本制備 （1）基礎(chǔ)樣本：取Glu濃度為7.0、11.1 mmol/L的血清作為基礎(chǔ)樣本；（2）測試樣本和對照樣本：基礎(chǔ)樣本以19︰1的比例稀釋Hb溶液作為測試樣本，稀釋后測試樣本的Hb濃度為5 g/L。以生理鹽水作為對照樣本。

1.4.2 檢測次數(shù)的計算 計算出允許的最大干擾值（dmax）/批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差（s）的值，利用dmax/s與檢測次數(shù)對應(yīng)表[3]得出2個濃度的檢測次數(shù)。s由基礎(chǔ)樣本連續(xù)測定20次計算得出，dmax為美國臨床實驗室改進(jìn)修正法規(guī)（the Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988，CLIA'88）規(guī)定的允許誤差的1/3，定義為T±3.33%。

1.4.3 檢測要求 為避免攜帶污染，增加額外樣本Cx（去離子水），按如下順序檢測：C1T1CxCxC2T2CxCx……CxCxCnTn，其中C為對照樣本、T為測試樣本。

1.4.4 干擾效應(yīng)評估 計算出dobs（測試樣本均值-對照樣本均值），與甄別值dc比較，若dobs≥dc，則存在干擾。dc在雙側(cè)檢驗時可通過公式計算得出：dc=（dnull+sZ1-α/2）式中dnull是無效假設(shè)規(guī)定的值，通常為0；s為批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差，Z1-α/2是從相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布到雙側(cè)檢驗中100（1-α）%的可信區(qū)間水平，n為重復(fù)測定次數(shù)。

1.5 劑量效應(yīng)試驗

1.5.1 樣本準(zhǔn)備 （1）干擾物高濃度（H）及低濃度（L）樣本：樣本制備方式同配對差異實驗；（2）測試樣本：按照L、3/4L+1/4H、1/2L+1/2H、2/4L+3/4H、H進(jìn)行配制。

1.5.2 測定次數(shù) 共測定3次，第1次由低濃度到高濃度，第2次由高濃度到低濃度，第3次由低濃度到高濃度。

1.5.3 劑量效應(yīng)分析 （1）線性效應(yīng)：如果數(shù)據(jù)成一條直線，可進(jìn)行線性回歸分析，在圖上繪制回歸線；（2）非線性效應(yīng)：若各濃度在作圖時顯示非線性，利用非線性回歸評估干擾物的干擾濃度。

2 結(jié)果

2.1 配對差異試驗

2.1.1 重測次數(shù)的確定 中、高濃度基礎(chǔ)樣本20次測定的Glu均值分別為6.95、 10.88 mmol/L，dmax分別為0.23、0.36 mmol/L，s分別為0.044、0.105 mmol/L。中、高濃度Glu的dmax/s均＞3，測定次數(shù)均為3次。

2.1.2 干擾效應(yīng)分析 中、高濃度Glu的dobs分別為0.77、0.93 mmol/L，dc分別為0.05、0.12 mmol/ L，dobs均＞dc，表明5 g/L Hb對Glu測定存在干擾。

2.2 劑量效應(yīng)實驗

依據(jù)劑量反應(yīng)干擾測試程序[3]，Hb對Glu測定產(chǎn)生非線性正干擾，見表1。中濃度Glu的非線性方程為Y=6.496+0.160 5X-0.013 10X2（r2=0.983）；高濃度Glu的非線性方程為Y=10.13+0.211 0X-0.017 83X2（r2=0.973），見圖1、圖2。

表1 Hb對Glu檢測的干擾劑量效應(yīng)結(jié)果

圖1 Hb對中濃度Glu干擾的劑量效應(yīng)圖

圖2 Hb對高濃度Glu干擾的劑量效應(yīng)圖

3 討論

由于居民生活水平的不斷提高，我國的糖尿病患病率已躍居全世界第2位，其發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)增長趨勢[4-5]。很多糖尿病患者 “三多一少”癥狀并不明顯，因此初期診斷是當(dāng)前防治糖尿病的難點與重點。糖耐量減低是糖尿病的最早期階段。臨床診斷糖尿病都從篩查糖耐量減低開始。目前，臨床常用口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）監(jiān)測空腹及餐后血糖，但由于需多次、不同部位采血，容易因抽血不暢而導(dǎo)致樣本溶血。OGTT在不同時間點的采血有嚴(yán)格的定義，一旦出現(xiàn)樣本溶血，退回重采的可能性很低。因此，溶血對Glu測定的影響，尤其是在醫(yī)學(xué)決定水平處的偏差可能會導(dǎo)致臨床醫(yī)生誤判病情。

本研究采用CLSI EP7-A2文件分析了溶血對Glu測定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示5 g/L Hb對Glu測定有明顯正干擾，可能與溶血導(dǎo)致的Hb干擾或細(xì)胞內(nèi)容物釋放有關(guān)[6]。Hb在主波長340 nm處有明顯的吸收峰，會干擾速率法中的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸檢測系統(tǒng)[7]。本研究結(jié)果顯示，隨著Hb濃度的增加，Glu的結(jié)果也呈假性增高。為避免該情況引起臨床醫(yī)生對患者病情的誤判，我們利用AU5800全自動生化分析儀的溶血指數(shù)測定功能，判斷樣本的溶血程度。AU5800全自動生化分析儀的溶血指數(shù)標(biāo)記如下：N為Hb＜0.50 g/ L，+為0.50 ～0.99 g/L，++為1.00～1.99 g/L，+++為2.00～2.99 g/L，++++為3.00～5.00 g/ L，+++++為＞5.0 g/L。依據(jù)本研究定義的dmax（T±3.33%），中、高濃度Glu允許的檢測結(jié)果上限均處于Hb 1.25～2.5 g/L之間，即溶血指數(shù)++及以上的樣本，其Glu檢測結(jié)果均不可接受。由于肉眼判斷溶血及溶血程度與儀器測定的溶血指數(shù)往往有著明顯的差異[8]，因此檢驗工作人員發(fā)出報告時應(yīng)充分利用儀器的溶血指數(shù)功能，在報告單上明確說明樣本的溶血程度，當(dāng)溶血為++及以上時，應(yīng)在檢測報告上注明結(jié)果偏高，數(shù)值僅供臨床參考。

[1]BONINI P，PLEBANI M，CERIOTTI F，et al.Errors in laboratory medicine[J]. Clin Chem，2002，48（5）：691-698.

[2]PLEBANI M，CARRARO P. Mistakes in a stat laboratory：types and frequency [J]. Clin Chem，1997，43（8 Pt 1）：1348-1351.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute.Interference testing in clinical chemistry[S]. EP7-A2，CLSI，2002.

[4]中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會糖尿病慢性并發(fā)癥調(diào)查組. 全國住院糖尿病患者慢性并發(fā)癥及其相關(guān)危險因素10年回顧性調(diào)查分析[J]. 中國糖尿病雜志，2003，11（4）：232-237.

[5]邵文琦，孫林，王蓓麗，等. 上海地區(qū)糖化血紅蛋白一致性計劃研究進(jìn)展[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)，2015，30（9）：948-952.

[6]LIPPI G，SALVAGNO G L，MONTAGNANA M，et al. Influence of hemolysis on routine clinical chemistry testing[J]. Clin Chem Lab Med，2006，44（3）：311-316.

[7]DA FONSECA-WOLLHEIM F. Haemoglobin interference in the bichromatic spectrophotometry of NAD（P）H at 340/380 nm[J]. Eur J Clin Chem Clin Biochem，1993，31（9）：595-601.

[8]HAWKINS R. Discrepancy between visual and spectrophotometric assessment of sample haemolysis[J]. Ann Clin Biochem，2002，39（Pt 5）：521-522.