MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)的臨床價(jià)值

董海波， 曾 慧， 張啟國， 周 敏， 袁翠英， 陳 兵

（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院血液科，江蘇 南京 210008 ）

CD34+抗原是唾液酸黏蛋白樣Ⅰ型跨膜磷酸糖蛋白，是一種高度糖基化分子，該抗原在人類造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞表面選擇表達(dá)[1]。如果造血功能穩(wěn)定，造血干細(xì)胞很少在骨髓與外周血循環(huán)間交換，但有許多因素可導(dǎo)致骨髓CD34+細(xì)胞向外周血循環(huán)遷移[1-2]。已有研究結(jié)果表明，急性白血病、骨髓纖維化等惡性血液病患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)存在異常增加現(xiàn)象[3-5]。另有研究結(jié)果表明，骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)不僅存在異常增加現(xiàn)象，而且與疾病危險(xiǎn)度分組、染色體核型、國際預(yù)后積分系統(tǒng)（the International Prognostic Scoring System，IPSS）預(yù)后積分等指標(biāo)相關(guān)。隨著研究工作的深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)即使疾病在低危階段，即難治性貧血（refractory anemia，RA）/難治性貧血伴環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞增多（refractory anemia with ring sideroblasts，RARS）/難治性貧血伴多系異常（refractory cytopenia with multilineage dysplasia，RCMD）階段，MDS患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)亦可出現(xiàn)增加的情況[6-8]。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2009年2月—2015年6月于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院血液科就診的52例MDS患者（男30例、女22例），年齡15～84歲。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）MDS診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均為MDS-RA/RARS/RCMD。另選取19名造血干細(xì)胞供者（男11名、女8名）為正常對照者，年齡22～38歲。

1.2 方法

1.2.1 外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測 采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）進(jìn)行檢測。鞘液使用ISOTON Ⅲ血細(xì)胞稀釋液（美國Beckman公司）。使用ProCOUNT 試劑盒（美國BD公司，批號為340498），該試劑盒配有核酸染料、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記的CD34單抗（抗HPCA22），多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物（peridinin-chlorophyllprotein complex，PerCP）標(biāo)記的CD45 單抗（抗HLe2l），PE標(biāo)記的同型對照IgG1。抽取患者、正常對照者靜脈血2 mL，運(yùn)用乙二胺四乙酸管進(jìn)行抗凝處理。取含有定量熒光微球的TruCOUNT管2支，分別標(biāo)記為測定（test，T）管、對照（control，C）管。T管中加入核酸染料/CD34 2PE/CD45 2PerCP試劑20 μL，C管中加入核酸染料/IgG1 2PE/CD45 2PerCP試劑20 μL。采用反向加樣法，分別加入標(biāo)本50 μL（應(yīng)預(yù)先對加入標(biāo)本進(jìn)行處理，將其有核細(xì)胞水平調(diào)整為15×109/L左右），混勻，室溫、避光染色15 min。加溶血素450 μL，室溫、避光放置30 min，旋渦混合器混勻5 s，上機(jī)檢測，運(yùn)用ProCOUNT軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.2 染色體檢測 取肝素抗凝骨髓5 mL，采用直接法、24 h培養(yǎng)法和同步法制備染色體。采用R帶技術(shù)顯帶，描述核型。根據(jù)IPSS預(yù)后積分，對MDS-RA/RARS/RCMD患者染色體核型進(jìn)行分組。染色體良好核型組包括正常染色體核型、-Y、5q-、20q-；染色體不良核型組包括復(fù)雜染色體核型異常（異常≥3種）、7號染色體核型異常；染色體中間核型組包括除上述2類以外的其他染色體核型異常。

1.2.3 其他檢查 所有患者均接受血常規(guī)檢查、骨髓涂片檢查和骨髓活檢。

1.3 IPSS預(yù)后積分及疾病危險(xiǎn)度分組

根據(jù)骨髓原始細(xì)胞百分比、骨髓造血細(xì)胞染色體核型和外周血細(xì)胞減少系列數(shù)進(jìn)行計(jì)分。0分計(jì)為低危，0.5～1.0分計(jì)為中危Ⅰ，1.5～2.0分計(jì)為中危Ⅱ，≥2.5分計(jì)為高危。

1.4 WHO分型預(yù)后積分系統(tǒng)（WHO-Based Prognostic Scoring System，WPSS）預(yù)后積分及疾病危險(xiǎn)度分組

根據(jù)WHO亞型、骨髓造血細(xì)胞染色體核型和有無輸血依賴進(jìn)行計(jì)分。0分計(jì)為極低危，1分計(jì)為低危，2分計(jì)為中危，3～4分計(jì)為高危，5～6分計(jì)為極高危。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Pearson χ2檢驗(yàn)以及 Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDS-RA/RARS/RCMD患者與正常對照者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞表達(dá)

正常對照者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞百分比和計(jì)數(shù)[中位數(shù)（范圍）]分別為0.04%（0.01%～0.14%）、[1.75（0.90～4.69）]×106/L，MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞百分比和計(jì)數(shù)[中位數(shù)（范圍）]分別為0.14%（0.01%～7.35%）、[3.01（0.17～208.00）]×106/L。MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞百分比和計(jì)數(shù)均高于正常對照者（p＜0.01）。所有正常對照者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)均＜10.00×106/L。見圖1、圖2。

2.2 MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)與臨床特點(diǎn)

MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)與性別、年齡、外周血血細(xì)胞減少程度、白細(xì)胞計(jì)數(shù)下降、幼稚前體細(xì)胞異常定位（abnormal localization of immature precursor，ALIP）現(xiàn)象均無相關(guān)性（r＜0.625，P＞0.05），而與染色體核型異常、IPSS預(yù)后積分、WPSS預(yù)后積分、骨髓纖維化相關(guān)（r＞0.995，p＜0.01）。外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)＞10.00×106/L的 MDSRA/RARS/RCMD患者共有16例，其余36例外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)＜10.00×106/L。

外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)＞10.00×106/L的16例MDS-RA/RARS/RCMD患者中，有12例伴有復(fù)雜染色體核型異常（異常≥3種），其中10例伴有7號染色體核型異常；有12例IPSS預(yù)后積分為中危Ⅱ；有13例WPSS預(yù)后積分為高危； 9例伴有骨髓纖維化。

36例外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)＜10.00×106/ L的MDS-RA/RARS/RCMD患者均不伴有復(fù)雜染色體核型異常及7號染色體核型異常；所有患者IPSS預(yù)后積分均為低?；蛑形＂?；除1例患者WPSS預(yù)后積分為高危外，其余患者的WPSS預(yù)后積分均為極低危、低?；蛑形＃怀?例患者伴有骨髓纖維化外，其余患者均不伴有骨髓纖維化。見圖3。

圖1 正常對照者與MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞百分比

圖2 正常對照者與MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)

圖3 外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)與MDS-RA/RARS/RCMD患者臨床特點(diǎn)示意圖

3 討論

CD34+抗原主要在人類造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞階段呈特異性表達(dá)。隨著造血細(xì)胞的不斷成熟，CD34+抗原表達(dá)逐漸減弱，直至消失。在穩(wěn)定的造血情況下，該抗原在有核循環(huán)血細(xì)胞上表達(dá)極低，約占未經(jīng)動員外周血單個核細(xì)胞的0.2%[9]。藥物誘導(dǎo)的干細(xì)胞動員、急性白血病、骨髓纖維化等均可導(dǎo)致骨髓CD34+細(xì)胞向外周血循環(huán)遷移[10]。

國內(nèi)外研究工作已證實(shí)MDS患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)存在異常增加現(xiàn)象，而且與疾病危險(xiǎn)度分組、不良細(xì)胞遺傳的出現(xiàn)、白血病相關(guān)生存率、IPSS預(yù)后積分等具有相關(guān)性，是急性白血病的早期信號。當(dāng)患者處于RA/RARS/RCMD階段，即“低?！彪A段時，其外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)往往＜10.00×106/L，而大多數(shù)“高?！?難治性貧血伴原始細(xì)胞增多（refractory anemia with excess blast，RAEB）階段的MDS患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)＞10.00×106/L，且隨著疾病危險(xiǎn)度的升高，外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)亦逐漸增加。當(dāng)對疾病狀態(tài)、預(yù)后分組進(jìn)行判斷時，外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)較CD34+細(xì)胞百分比更敏感。KNIPP等[11]研究使用10.00×106/L作為初診MDS患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)的臨界值，可較好地鑒別疾病“低?！薄案呶！睜顟B(tài)。

對急性白血病，尤其是對急性早幼粒細(xì)胞白血病的研究發(fā)現(xiàn)，急性早幼粒細(xì)胞白血病患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)均＜10.00×106/L。隨著研究工作的深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，部分急性早幼粒細(xì)胞白血病患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)亦可出現(xiàn)＞10.00×106/L的情況，此類患者往往具有一種或多種諸如復(fù)雜染色體核型異常、FLT3-ITD基因陽性突變、PML/RARa融合基因復(fù)雜融合、高白細(xì)胞計(jì)數(shù)的不良預(yù)后因素。當(dāng)把MDS限定在RA/RARS/RCMD“低危”階段時，多數(shù)MDS患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)符合既往研究規(guī)律，即＜10.00×106/L。部分急性早幼粒細(xì)胞白血病RA/RARS/RCMD階段患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)可＞10.00×106/L。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞計(jì)數(shù)的多少與患者性別、年齡、外周血細(xì)胞減少程度、白細(xì)胞計(jì)數(shù)下降、ALIP現(xiàn)象均無相關(guān)性，而與染色體核型異常、IPSS預(yù)后積分、WPSS預(yù)后積分、骨髓纖維化等不良預(yù)后因素有關(guān)[6-8]。

克隆性染色體核型異常是MDS最主要的克隆性造血證據(jù)，不僅是MDS的確診條件之一，還是MDS患者的獨(dú)立預(yù)后因素，不同染色體核型預(yù)后分組是確定不同治療方案的主要依據(jù)。復(fù)雜染色體核型異常尤其是7號染色體核型異常是MDS的高危預(yù)后因素。具有上述染色體核型異常的MDS患者，疾病更易進(jìn)展，并易向急性白血病轉(zhuǎn)化，常規(guī)治療方案效果差，臨床需采取更為積極的治療策略[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)＞10.00×106/L的MDS-RA/RARS/RCMD患者，有75.0%（12/16）伴有復(fù)雜染色體核型異常（異常≥3種），并且其中83.3%（10/12）的患者為7號染色體核型異常，并伴有其他染色體核型異常。這一結(jié)果表明，MDSRA/RARS/RCMD患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)＞10.00×106/L提示患者可能具有不良染色體核型，疾病轉(zhuǎn)化為白血病的可能性較大，患者中位生存期短，預(yù)后不良。然而，外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)未＞10.00×106/L的MDS-RA/RARS/RCMD患者，不伴有復(fù)雜染色體核型異常。

近年來，常用IPSS及WPSS對疾病危險(xiǎn)度進(jìn)行分組，并為MDS治療提供了準(zhǔn)確的指導(dǎo)方向。隨著預(yù)后積分的升高，患者中位生存期及疾病向白血病轉(zhuǎn)化的時間縮短。IPSS預(yù)后積分為中危Ⅱ和高危的MDS患者與WPSS預(yù)后積分為高危和極高危的MDS患者，往往疾病惡性程度高、預(yù)后不良，臨床醫(yī)師應(yīng)采用更為行之有效的化療方案[14]。本研究發(fā)現(xiàn)外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)＞10.00×106/L的MDS-RA/RARS/RCMD患者中分別有75.0%（12/16）及81.3%（13/16）的患者IPSS預(yù)后積分為中危Ⅱ及WPSS預(yù)后積分為高危，而外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)未 ＞10.00×106/L的MDS-RA/RARS/RCMD患者IPSS預(yù)后積分均為低危或中危Ⅰ，除1例WPSS預(yù)后積分為高危外，其余患者的WPSS預(yù)后積分均為極低危、低危或中危。

MDS患者除了有骨髓病態(tài)造血的情況外，還可能伴有骨髓纖維化。MDS伴有骨髓纖維化是疾病的獨(dú)立不良預(yù)后因素[15]。本研究發(fā)現(xiàn)52例MDS-RA/RARS/RCMD患者10例伴有骨髓纖維化，其中9例患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù) ＞10.00×106/L，而外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)未＞10.00×106/L的患者僅有1例伴有骨髓纖維化。

綜上所述，MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)可出現(xiàn)異常增加，外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)＞10.00×106/L的患者多伴有復(fù)雜染色體核型異常，疾病危險(xiǎn)度高，預(yù)后不良。外周血循環(huán)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測方便、簡單，患者痛苦小，有助于對MDS患者疾病危險(xiǎn)度的進(jìn)一步分層，具有一定的臨床實(shí)用價(jià)值。

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