銀杏內(nèi)酯B對心肌缺血再灌注心律失常大鼠的作用及機(jī)制研究*

柴麗娜 杜 蕊 張艷艷

（1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001；2.冀中能源峰峰集團(tuán)總醫(yī)院，河北 邯鄲056200）

心律失常（arrhythmia）是心肌缺血再灌注后常見并發(fā)癥，室性心動(dòng)過速（VT）和心室顫動(dòng)（VF）是其主要表現(xiàn)形式，嚴(yán)重者甚至危及生命［1]，有效防治心律失常已經(jīng)成為減輕心肌缺血再灌注損傷的研究熱點(diǎn)。銀杏內(nèi)酯B（GB）是中藥銀杏葉的主要活性成分之一，既往研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B能夠通過抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡而對心肌缺血再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用［2-4]，但關(guān)于銀杏內(nèi)酯B影響心肌缺血再灌注性心律失常的文獻(xiàn)報(bào)道尚不多見。本實(shí)驗(yàn)于2017年8月至9月間開展，2017年10月至11月完成數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與論文的撰寫。本課題組通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支建立心肌缺血再灌注性心律失常大鼠模型，以維拉帕米為陽性對照藥物，探討銀杏內(nèi)酯B對心肌缺血再灌注性心律失常的作用及其可能的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級雄性SD大鼠，8周齡，220～260 g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（冀）2013-1-003。 飼養(yǎng)環(huán)境：23～25 ℃、相對濕度55%～60%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑 銀杏內(nèi)酯B購自美國Sigma公司（批號(hào)：33570）；維拉帕米注射液購自上海禾豐制藥有限公司 （批號(hào)：43170116）；SOD、GSH-Px、MDA、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號(hào)：170113、161217、161029、160815、161010）；鈣標(biāo)準(zhǔn)液（上海生物制品研究所）。

1.3 主要儀器 動(dòng)物呼吸機(jī)（X-300型，成都泰盟儀器廠）；三道心電圖機(jī)（XD-30C型，上海醫(yī)用電子儀器廠）；紫外-可見分光光度計(jì)（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）；原子吸收光度計(jì)（WFD-Y2型，北京第二光學(xué)儀器廠）。

1.4 分組與造模 將120只實(shí)驗(yàn)用大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、維拉帕米2.5mg/（kg·d）組與銀杏內(nèi)酯 B 低、中、高劑量組［15、30、60mg/（kg·d）]，每組各20只。銀杏內(nèi)酯B各劑量組和維拉帕米組分別連續(xù)腹腔注射給藥7 d，每日1次，假手術(shù)組和模型組給予18mg/（kg·d）0.9%氯化鈉注射液。最后1次給藥2 h后，參照睢大員等［5]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法，通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支建立心肌缺血再灌注性心律失常大鼠模型，結(jié)扎30 min后恢復(fù)再灌注，假手術(shù)組行手術(shù)通路但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，連接Ⅱ?qū)?lián)心電圖實(shí)施監(jiān)測。造模成功的判斷［6]：心電圖示ST段抬高、心肌局部變蒼白示結(jié)扎成功；蒼白心肌恢復(fù)紅潤、ST段抬高恢復(fù)1/2以上示再灌注成功。再灌注60 min后行各指標(biāo)檢測。

1.5 監(jiān)測指標(biāo) 全程實(shí)施Ⅱ?qū)?lián)心電圖監(jiān)測，再灌注60min后記錄各組大鼠心電圖PR間期、QRS間期、ST段變化；觀察并計(jì)算VT、VF的發(fā)生率；心律失常評分方法［7]：未發(fā)生或＜5次室性前期收縮，計(jì) 0分；僅≥5次室性前期收縮，計(jì)1分；僅＜60s室性心動(dòng)過速，計(jì)2分；一陣≥60 s或多陣?yán)塾?jì)＜60 s室性心動(dòng)過速，計(jì)3分；多陣VT累計(jì)＞60 s，計(jì)4分；出現(xiàn)VF計(jì)5分。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 1）心肌組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性及Ca2+濃度檢測。麻醉后，開胸取心臟組織，于4℃環(huán)境剪碎、加入適量冷裂解液后研磨勻漿，制備10%組織勻漿液，3500 r/min離心10 min取上清液，按照各檢測試劑盒操作方法，通過紫外-可見分光光度計(jì)檢測心肌組織中Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性；心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度以Ca2+標(biāo)準(zhǔn)液為標(biāo)準(zhǔn)對照，通過原子吸收光度計(jì)測定。2）心肌組織抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活性及MDA含量檢。取上述步驟制備好心肌組織勻漿液，按照各檢測試劑盒操作方法，通過紫外-可見分光光度計(jì)檢測SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心電圖PR間期、QRS間期、ST段變化比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠PR間期、QRS間期顯著縮短而ST段明顯抬高（P＜0.01）；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯 B 30、60mg/（kg·d）組和維拉帕米2.5mg/（kg·d）組 PR 間期、QRS 間期顯著延長且 ST 段抬高程度顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組大鼠心電圖PR間期、QRS間期、ST段變化比較（±s）

表1 各組大鼠心電圖PR間期、QRS間期、ST段變化比較（±s）

與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

組 別 n ST段（mV）假手術(shù)組 20 0.23±0.04模型組 20 0.53±0.07**銀杏內(nèi)酯 B 15mg/（kg·d）組 20 0.50±0.08 PR 間期（ms） QRS間期（ms）44.74±4.84 32.36±2.92 31.81±4.63** 21.04±2.68**33.94±4.99 22.47±2.57銀杏內(nèi)酯 B 30mg/（kg·d）組 20 0.42±0.08△36.48±5.27△ 25.88±3.01△銀杏內(nèi)酯 B 60mg/（kg·d）組 20 36.89±5.30△ 27.76±3.35△△ 0.34±0.05△△維拉帕米 2.5mg/（kg·d）組 20 36.06±4.85△ 26.34±2.80△ 0.35±0.07△△

2.2 各組大鼠心律失常發(fā)生率比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠VT、VF發(fā)生率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯 B 30、60mg/（kg·d）組和維拉帕米 2.5 mg/（kg·d） 組大鼠 VT、VF發(fā)生率顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 各組大鼠心律失常評分比較 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心律失常評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯 B 30、60mg/（kg·d）組和維拉帕米 2.5mg/（kg·d）組大鼠心律失常評分顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠VT、VF發(fā)生率比較n（%）

表3 各組大鼠心律失常評分比較（分，±s）

表3 各組大鼠心律失常評分比較（分，±s）

組 別 n假手術(shù)組 20模型組 20銀杏內(nèi)酯 B 15mg/（kg·d）組 20心律失常評分0.00±0.00 4.28±1.02**4.13±1.14銀杏內(nèi)酯 B 30mg/（kg·d）組 20 3.27±0.82△銀杏內(nèi)酯 B 60mg/（kg·d）組 20 2.04±0.49△△維拉帕米 2.5mg/（kg·d）組 20 2.43±0.55△△

2.4 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性及Ca2+濃度比較 見表4。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著降低而Ca2+濃度顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較， 銀杏內(nèi)酯 B 30、60mg/（kg·d） 組和維拉帕米2.5 mg/（kg·d） 組 Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性均顯著升高且Ca2+濃度顯著降低 （P＜0.05或P＜0.01）。

表4 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性及 Ca2+濃度比較（±s）

表4 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性及 Ca2+濃度比較（±s）

Ca2+-Mg2+-ATPase［μmol/（mg·h）]4.07±0.98 4.31±1.15 2.46±0.52** 2.28±0.36**2.75±0.70 2.59±0.57△銀杏內(nèi)酯 B 30mg/（kg·d）組 20 4.58±1.42△△組 別 n Ca2+（mmol/L）假手術(shù)組 20 2.63±0.81模型組 20 6.44±1.72**銀杏內(nèi)酯 B 15mg/（kg·d）組 20 5.79±1.85 Na+-K+-ATPase［μmol/（mg·h）]3.04±0.61△ 2.86±0.60△銀杏內(nèi)酯 B 60mg/（kg·d）組 20 3.55±0.87△△ 3.97±1.12△△ 3.03±0.68△△維拉帕米 2.5mg/（kg·d）組 20 3.12±0.68△ 3.04±0.75△ 4.17±0.95△

2.5 各組大鼠心肌組織抗氧化酶活性和MDA含量比較 見表5。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織抗氧化酶SOD、GSH-Px活性顯著降低而MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯 B 30、60 mg/（kg·d）組 SOD、GSH-Px活性顯著升高且 MDA 含量顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），維拉帕米 2.5 mg/（kg·d）組SOD活性顯著升高且MDA含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表5 各組大鼠心肌組織抗氧化酶活性和MDA含量比較（±s）

表5 各組大鼠心肌組織抗氧化酶活性和MDA含量比較（±s）

組 別 n MDA（nmol/mg）假手術(shù)組 20 3.68±0.75模型組 20 9.51±1.63**銀杏內(nèi)酯 B 15mg/（kg·d）組 20 8.19±1.57 SOD（U/mg）GSH-Px（U/mg）67.37±8.32 61.46±7.43 46.87±5.96** 45.30±5.62**49.70±6.27 49.75±5.76銀杏內(nèi)酯 B 30mg/（kg·d）組 20 6.52±1.28△△54.01±7.03△ 57.59±6.30△銀杏內(nèi)酯 B 60mg/（kg·d）組 20 64.99±9.15△△ 59.06±7.84△ 4.84±1.03△△維拉帕米 2.5mg/（kg·d）組 20 55.28±6.30△ 53.40±6.26 6.17±1.25△△

3 討 論

使冠狀動(dòng)脈再通、恢復(fù)血流再灌注是治療缺血性心臟病的首選方案，但缺血再灌注損傷并發(fā)癥嚴(yán)重影響著患者預(yù)后，尤其再灌注性心率失常是導(dǎo)致心肌梗死患者早期死亡的主要原因［8-9]，因此開發(fā)抗缺血再灌注性心率失常藥物具有重要意義。

維拉帕米為臨床治療心律失常常用藥物，能夠通過阻滯鈣離子通道而達(dá)到抑制心肌缺血性心律失常的作用［10]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇維拉帕米作為陽性對照藥物。銀杏葉為銀杏科銀杏屬多年生落葉喬木銀杏的葉，是我國傳統(tǒng)中藥品種，《本草綱目》和《中藥志》中均有記載，其性味甘苦澀平，具有益心斂肺、化濕止瀉之功效。現(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，萜內(nèi)酯類化合物為銀杏葉的主要有效成分，包括銀杏內(nèi)酯（Ginkgolide）A、B、C、M 和白果內(nèi)酯，其中活性最強(qiáng)的即為銀杏內(nèi)酯B（Ginkgolide B，GB）。本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支的方法建立心肌缺血再灌注性心律失常大鼠模型，術(shù)前7 d（每日1次）腹腔注射給予銀杏內(nèi)酯B進(jìn)行干預(yù)，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)銀杏內(nèi)酯B 30～60mg/kg預(yù)處理能夠有效延長心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心電圖PR間期、QRS間期并降低ST段抬高程度，降低VT、VF發(fā)生率，降低心律失常評分，提示銀杏內(nèi)酯B對心肌缺血再灌注性心律失常具有一定的保護(hù)作用。

心肌細(xì)胞生存與做功均依賴有氧代謝ATP，因此線粒體中ATPase活性對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及細(xì)胞內(nèi) Na+、K+、Ca2+、Mg2+等離子穩(wěn)定具有重要作用［11]。 心肌缺血缺氧將導(dǎo)致能量代謝障礙，進(jìn)而引發(fā)依賴ATP的Ca2+-Mg2+-ATPase活力降低；而Ca2+-Mg2+-ATPase是將Ca2+泵出細(xì)胞外的主要途徑，其活力下降將致胞內(nèi)Ca2+超載而引發(fā)心律失常［12-13]。氧自由基損傷是心臟組織缺血再灌注損傷的重要病理機(jī)制之一［14]，而氧自由基的損傷及能量耗竭，使Na+-K+-ATPase活力進(jìn)一步降低，使細(xì)胞外K+增多，且呈現(xiàn)自缺血中央?yún)^(qū)至邊緣區(qū)K+含量逐漸下降的不均勻分布態(tài)勢［15-16]，而局部K+分布不均勻可促進(jìn)心律失常的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)銀杏內(nèi)酯B 30～60 mg/kg預(yù)處理能夠改善Ca2+-Mg2+-ATPase、Na+-K+-ATPase活力并降低Ca2+含量，改善抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活性并降低MDA含量，這可能是銀杏內(nèi)酯B抑制心肌缺血再灌注性心律失常的重要分子機(jī)制之一。

綜上所述，銀杏內(nèi)酯B對大鼠心肌缺血再灌注性心律失常具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與改善Ca2+-Mg2+-ATPase、Na+-K+-ATPase 活力并降低 Ca2+含量以及抑制氧自由基損傷有關(guān)。

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