siRNA慢病毒載體介導DKK-1基因沉默對骨髓間充質(zhì)干細胞分化影響的實驗研究*

岳辰張雪溫陽陽劉又文**康鵬德

（1.河南省洛陽正骨醫(yī)院河南省骨科醫(yī)院髖部損傷治療中心，河南洛陽471000；

2.河南省洛陽正骨醫(yī)院河南省骨科醫(yī)院風濕科，河南洛陽471000；

3.河南中醫(yī)藥大學洛陽研究生培養(yǎng)工作部，河南洛陽471000；4.四川大學華西醫(yī)院骨科，成都610041；）

股骨頭壞死（osteonecrosis of femoral head,ONFH）是骨科常見的難治性疾病之一。中國是ONFH的高發(fā)國家，其病因主要包括創(chuàng)傷、糖皮質(zhì)激素應(yīng)用、酗酒等[1]。其中長期大劑量或短期超大劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素是ONFH最常見的誘因之一[2,3]，以上述方法應(yīng)用糖皮質(zhì)激素患者的激素性股骨頭壞死（steroid-induced osteonecrosis of femoral head,SONFH）的發(fā)生率甚至可超過40%[4]。

近年來大量研究指出，SONFH的發(fā)生與骨代謝紊亂密切相關(guān)，在超生理劑量糖皮質(zhì)激素作用下，股骨頭內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC）成脂分化增加，成骨分化減少、骨修復能力減弱，從而進一步導致股骨頭內(nèi)壓力增高，骨修復停滯，最終導致ONFH[5-9]，而這一病理生理過程的發(fā)生、發(fā)展可能與經(jīng)典Wnt信號通路的失調(diào)有緊密聯(lián)系[7-9]。

Wnt信號通路是存在于自然界多種生物中的一條高度保守的信號傳導途徑，與細胞增殖、分化，胚胎發(fā)育等多種生理過程密切相關(guān)。Wnt通路可分為經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路與非經(jīng)典通路，而Wnt/β-catenin信號通路與骨代謝密切相關(guān)，各種原因?qū)е碌腤nt/β-catenin信號通路失調(diào)可能是導致骨質(zhì)疏松、骨壞死等多種骨科疾病的重要原因之一[10-12]。

BMSC是存在于成體骨髓中的多能干細胞，正常生理條件下，BMSC按一定比例進行成骨與成脂分化，在維持骨代謝的動態(tài)平衡中起著極為重要的作用[13]。Wnt/β-catenin信號通路的激活和傳導是促進BMSC向成骨細胞分化、增殖，抑制成脂分化，調(diào)節(jié)骨代謝平衡的關(guān)鍵[10-12]。正常生理情況下，Wnt/β-catenin信號通路處于激活狀態(tài)，促進BMSC成骨分化，并抑制其成脂分化。其生理過程可簡單概括為Wnt糖蛋白與其受體卷曲蛋白特異性結(jié)合形成受體復合體，進入細胞并使胞質(zhì)內(nèi)的糖原合成激酶3β失活，抑制βcatenin的磷酸化和降解，從而進一步激活成骨相關(guān)基因Runx-2轉(zhuǎn)錄，促進BMSC成骨細胞分化，同時抑制成脂相關(guān)基因PPAR-γ轉(zhuǎn)錄而抑制BMSC成脂分化和成熟[14,15]。而胞外蛋白Dickkopf-1（DKK-1）對Wnt/β-catenin信號通路的正常激活起負向調(diào)節(jié)作用[16-18]，是經(jīng)典Wnt信號通路的抑制劑。DKK-1通過作用于包膜Wnt相關(guān)糖蛋白，阻抑其與卷曲蛋白相結(jié)合形成復合體，從而抑制正常Wnt信號通路的傳導和激活，抑制其生物調(diào)節(jié)功能。近年來的研究證實，超生理劑量激素性可能通過激活DKK-1過表達而抑制經(jīng)典Wnt信號通路的表達，導致BMSC異常分化，從而引起ONFH[16-18]。

因此，本實驗選擇Wnt/β-catenin信號通路，以DKK-1基因作為靶點，通過RNA干擾技術(shù)，利用慢病毒作為載體，將DKK-1 siRNA導入激素誘導下的BMSC進行長效的基因沉默，研究特異性抑制DKK-1過表達對超生理劑量糖皮質(zhì)激素作用下Wnt/βcatenin通路的調(diào)控作用及對BMSC分化的影響，探索SONFH的發(fā)病機制，并為研究SONFH防治的新途徑、新方法提供有效數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 大鼠BMSC樣本來源

本實驗所提取的BMSC均由SD大鼠長骨骨髓中獲得。SPF級SD大鼠乳鼠由達碩生物科技有限公司提供，1周齡，雌雄不限，體重20～30 g。

1.2 主要試劑

成骨誘導液（美國GIBCO公司提供），成脂誘導液（美國GIBCO公司提供），倉鼠抗大鼠CD29單克隆抗體（美國BD公司提供），小鼠抗大鼠CD44單克隆抗體（美國BD公司提供），小鼠抗大鼠CD90單克隆抗體（美國BD公司提供），人抗大鼠CD34單克隆抗體（美國Santa Cruz公司提供），小鼠抗大鼠CD45單克隆抗體（美國BD公司提供），DKK-1基因慢病毒干擾載體及病毒感染增強液polybrene（上海吉凱公司提供），RNA引物（中國擎科生物公司提供），地塞米松（美國Sigma公司提供），兔抗大鼠RUNX2單克隆抗體（美國CST公司提供），山羊抗大鼠PPARγ-2多克隆抗體（美國Santa Cruz公司提供），兔抗大鼠GSK-3β單克隆抗體（美國CST公司提供），兔抗大鼠β-catenin單克隆抗體（美國CST公司提供），兔抗大鼠DKK-1多克隆抗體（美國CST公司提供），兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體（美國CST公司提供）。

本實驗DKK-1基因慢病毒干擾載體購自上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司，采用3質(zhì)粒系統(tǒng)包裝病毒。而本實驗目的序列通過Genebank查找：通過Pubmed miRNAbase檢索大鼠DKK-1全長cDNA序列（NM_001106350），通過Invitrogen軟件設(shè)計目的序列GTACAAATCTGCCTGGCTT，同時設(shè)計一條無序序列TTCTCCGAACGTGTCACGT用于對照組實驗，通過BLAST比對驗證該序列對其他基因序列的靶向性無干擾效果。

各基因序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，最后一個循環(huán)72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，以UVP凝膠密度掃描儀對各基因特異性擴增產(chǎn)物的電泳條帶進行密度掃描，用Labwork 3.0軟件分析電泳條帶密度值。

表 1 各基因序列

1.3 實驗方法

將大鼠處死后取其雙側(cè)股骨及脛骨，取含骨髓液離心（1300 rpm，5 min），用含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)（37℃，5%CO2），首次換液時間為48 h，之后每48 h換液1次，細胞貼壁達到80%以上后按1:3傳代。取第3代細胞倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并成骨及成脂分化誘導，流式細胞學進行CD29、CD44、CD90、CD34、CD45表型鑒定。取第3代BMSC，分為對照組（A組）、激素組（B組）、激素+無序序列慢病毒載體組（C組）及激素+DKK-1慢病毒載體組（D組）進行實驗。C、D組進行慢病毒載體轉(zhuǎn)染，前期預實驗已確定慢病毒載體轉(zhuǎn)染最佳濃度為感染復數(shù)（multiplicity of infection,MOI）=25，A、B組常規(guī)更換培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染96 h后，吸去各組培養(yǎng)基，A組更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基，B、C、D組加入含1×10-6mol/L地塞米松的培養(yǎng)基。以后每48 h全量換液，A組仍更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基，B、C、D組更換含上述濃度地塞米松的培養(yǎng)基。每日觀察，待細胞達到80%融合時進行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d后，提取各組細胞RNA及蛋白，對DKK-1、PPAR-γ2和RUNX2進行Real-time PCR檢測及Western-blot檢測，并對各組進行油紅O、茜素紅染色，觀察各組BMSC分化情況。實驗簡要流程見圖1。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SSPS 20.0進行統(tǒng)計學分析，兩組間數(shù)據(jù)結(jié)果比較采用t檢驗，兩組以上組間比較采用單因素方差分析；P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 BMSC的鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)學鑒定：原代細胞培養(yǎng)并傳至第3代已純化，幾乎所有細胞呈長梭形，并隨細胞量的增加逐漸由長梭形變?yōu)槎趟笮危毎w呈波浪形，貼滿瓶底（圖2）。

2.1.2 成骨及成脂分化誘導染色鑒定：對第3代BMSC進行成骨分化誘導14 d，茜素紅染色陽性，倒置相差顯微鏡下觀察可見散在分布的橘紅色團塊沉積（圖3）。對第3代BMSC進行成脂分化誘導21 d，油紅O染色陽性，倒置相差顯微鏡下觀察可見大量紅染圓形脂滴（圖4）。

2.1.3 流式細胞學表型鑒定：流式細胞儀檢測細胞表型顯示所提取細胞CD29、CD44、CD90表達率分別為100%、100%、99.9%，CD34、CD45表達率分別為0.4%及0.5%。

2.2 MOI=25時DKK- 1慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率

MOI=25時，螢光顯微鏡下可見大量熒光轉(zhuǎn)染區(qū)（圖5），流式細胞儀檢測DKK-1慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率已超過90%（圖6）。

圖1 簡要流程圖

圖2 第三代BMSC已純化，幾乎所有細胞呈長梭形（40×）

圖3 第三代BMSC成骨誘導14 d，可見散在分布的橘紅色團塊沉積，茜素紅染色（+）（100×）

圖4 第三代BMSC成脂誘導21 d，可見大量紅染圓形脂滴，油紅O染色（+）（100×）

2.3 不同組間DKK- 1、PPAR- γ 2及RUNX 2基因的表達

2.3.1 DKK-1：B、C組與A、D組相比，DKK-1表達顯著增高（P＜0.05，圖7）。B組DKK-1的RNA相對表達量是A組的3.8倍，而D組的RNA相對表達量也明顯低于B組（P=0.014，圖7）。

2.3.2 成脂相關(guān)基因PPAR-γ2：B、C組與A、D組相比，成脂相關(guān)基因PPAR-γ2表達明顯升高，（P＜0.05，圖8）。B組PPAR-γ2的RNA相對表達量是A組的1.98倍，而D組PPAR-γ2的RNA相對表達量明顯低于B組，但與A組相比差異無統(tǒng)計學意義（P=0.262，圖8）。

2.3.3 成骨相關(guān)基因RUNX2：B、C組與A、D組相比，成骨相關(guān)基因RUNX2表達顯著降低（P＜0.05，圖9）。B組RUNX2的RNA相對表達量是A組的45%（P=0.000，圖9）,而D組RUNX2的相對表達量明顯高于B組，但與A組相比差異無統(tǒng)計學意義（P=0.169，圖9）。

2.4 不同組間Wnt通路相關(guān)蛋白的表達

2.4.1 DKK-1：B、C組與A、D組相比，DKK-1蛋白表達顯著增高（P＜0.05，圖10）。B組DKK-1的相對表達量是A組的1.7倍,而D組DKK-1蛋白的表達也明顯低于B組（P＜0.05，圖10）。

2.4.2 成脂相關(guān)基因PPAR-γ2：B、C組與A、D組相比，成脂相關(guān)基因PPAR-γ2蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖11）。B組PPAR-γ2的相對表達量是A組的2.1倍，而D組PPAR-γ2的相對表達量明顯低于B組（P＜0.05，圖11）。

圖5 MOI=25，熒光顯微鏡下可見大量熒光轉(zhuǎn)染區(qū)（100×）

圖6 MOI=25，DKK-1慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率為90.93%

圖7 各組間DKK-1的RNA相對表達量

圖8 各組間PPAR-γ2的RNA相對表達量

圖9 各組間RUNX2的RNA相對表達量

2.4.3 成骨相關(guān)基因RUNX2：B、C組與A、D組相比，成骨相關(guān)基因RUNX2蛋白表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖12）。B組RUNX2的相對表達量僅為A組的66%，而D組RUNX2的相對表達量明顯高于B組，但與A組相比差異無明顯統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖12）。

2.5 不同組間的細胞分化

各組的BMSC培養(yǎng)至14 d后進行油紅O及茜素紅染色，倒置相差顯微鏡觀察各組BMSC分化情況。結(jié)果顯示B組及C油紅O染色陽性、茜素紅染色陰性。A組及D組油紅O染色陰性、茜素紅染色陽性（圖13、14）。

3 討論

SONFH的發(fā)病機制尚不完全清楚，目前主要的假說包括骨內(nèi)高壓學說、凝血機制改變學說、骨質(zhì)疏松學說、骨細胞凋亡學說等[19-21]，雖各有一些臨床和實驗研究依據(jù)，但均不能完全解釋SONFH的全部病理過程。其中，股骨頭內(nèi)骨代謝紊亂，骨細胞活性的改變是上述多種學說的中間作用環(huán)節(jié)，因此越來越多的學者逐漸重視ONFH過程中骨代謝及骨細胞活性的變化，并認為BMSC脂肪變及成骨分化障礙使髓腔的壓力增高、骨修復能力降低，這可能在ONFH的發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用，而超生理劑量糖皮質(zhì)激素引起的BMSC異常分化是這一過程的始動環(huán)節(jié)[20,21]。

目前研究認為Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)節(jié)BMSC正常分化的關(guān)鍵信號通路，超生理劑量激素能夠通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路拮抗因子DKK-1的表達阻抑Wnt/β-catenin信號通路的激活，介導PPAR-γ2高表達和Runx2低表達，從而導致BMSC成脂分化增加、成骨分化減少，最終形成骨髓腔內(nèi)脂肪細胞多于成骨細胞，股骨頭髓腔壓力增加，股骨頭發(fā)生壞死[14-18]。

圖10 各組間DKK-1蛋白表達（內(nèi)參GAPDH）

圖11 各組間PPAR-γ2蛋白表達（內(nèi)參GAPDH）

圖12 各組間RUNX2蛋白表達（內(nèi)參GAPDH）

圖13 各組油紅O染色結(jié)果（陽性為圓形紅染區(qū)，代表BMSC成脂分化）

圖14 各組茜素紅染色結(jié)果（陽性結(jié)果為紅色局部區(qū)域，代表鈣結(jié)節(jié)形成，BMSC成骨分化）

胞外蛋白DKK-1對Wnt/β-catenin信號通路的正常激活起負向調(diào)節(jié)作用，是經(jīng)典Wnt信號通路的抑制劑，通過對DKK-1的抑制，理論上可以同時調(diào)控PPAR-γ2和Runx2的表達，從而調(diào)控BMSC的異常分化[14,15]。DKK-1蛋白屬于Dickkopf家族，作為一種分泌型胞外蛋白，DKK-1可與細胞膜表面的Wnt/βcatenin受體LRP5/6和DKK-1共受體Kremen1或Kremen2結(jié)合，形成內(nèi)吞小體，減少細胞膜表面的LRP5/6的數(shù)量，抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活[17]。有研究表明，DKK-1的異常表達會造成骨質(zhì)疏松，而通過藥物或基因技術(shù)特異性抑制DKK-1的表達可能會起到治療目的[22]。使用DKK-1的中和抗體可以增加多發(fā)性骨髓瘤腫瘤細胞的小鼠骨組織中成骨細胞的數(shù)量，而利用基因技術(shù)敲除或沉默DKK-1基因可以促進成骨細胞的增殖、分化，增加骨量[23]。因此，以DKK-1作為靶點調(diào)節(jié)Wnt信號通路，對于以骨量減少為特點的骨科疾病，可能是一種有效的治療方法。對于超生理劑量激素引起的BMSC分化異常，以往的研究多以PPAR-γ2或Runx2基因為靶點，雖然得到了較好的實驗結(jié)果，但若能以一種同時調(diào)控PPAR-γ2和Runx2的基因為靶點，可能對于重新調(diào)控超生理劑量激素引起的BMSC異常分化是一種新的思路。

因此，基于以往研究的基礎(chǔ)進行了本實驗，結(jié)果顯示超生理劑量激素可通過致DKK-1過表達而抑制Wnt/β-catenin信號通路的正常激活，進而上調(diào)成脂相關(guān)基因PPAR-γ2的表達、同時下調(diào)成骨基因RUNX2的表達，誘導BMSC向脂肪細胞方向分化，并抑制其成骨分化。DKK-1基因慢病毒干擾載體可以通過基因沉默，特異性抑制DKK-1過表達而重新激活Wnt/β-catenin信號通路，有效減少成脂相關(guān)基因PPAR-γ2的表達、增加成骨基因RUNX2的表達。染色結(jié)果顯示，通過DKK-1基因沉默，成功抑制BMSC成脂分化，促進BMSC分化成為有生物活性的成骨細胞，為早期SONFH的治療提供了新的思路。

由于Wnt/β-catenin信號通路在生物體內(nèi)廣泛存在，而DKK-1的高表達也不完全是有害的，盲目抑制DKK-1表達可能會對機體內(nèi)其他臟器、組織產(chǎn)生影響，所以進行相應(yīng)的動物實驗以驗證其有效性及安全性是利用DKK-1基因治療SONFH的下一步研究方向，也是本實驗的最大不足。相信本實驗結(jié)果能為下一步的研究提供可靠的實驗數(shù)據(jù)。

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