哺乳動(dòng)物的手工克隆技術(shù)與研究進(jìn)展

王巨龍

摘 要：哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)（Somatic Cell nuclear transfer，SCNT）近幾十年的發(fā)展取得了巨大的成就，但由于需要繁瑣的技術(shù)、昂貴的顯微操作儀且核移植效率不理想，阻礙了核移植克隆的規(guī)?；l(fā)展。近年來(lái)科學(xué)界運(yùn)用了新的革新方法—體細(xì)胞手工克?。℉andmade Somatic Cell Cloning，HCM），其操作無(wú)需顯微操作儀，對(duì)操作人的技術(shù)要求不高，是純手工核移植技術(shù)。該技術(shù)不僅簡(jiǎn)化操作程序，還提高核移植效率，對(duì)今后哺乳動(dòng)物核移植研究有重要的推動(dòng)作用。該綜述將從核移植技術(shù)的研究與進(jìn)展方面，探討限制手工克?。℉CM）的因子并以此來(lái)優(yōu)化手工克隆技術(shù)。

關(guān)鍵詞：卵母細(xì)胞；手工克?。蝗ネ该鲙?；核移植

中圖分類號(hào) S855.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）09-0120-04

The Handmade Cloning Technology and Research Progress on Mammalian

Wang Julong

（Department of Biology Engineering，Wuhu Institute of Technology，Wuhu 241003，China）

Abstract：Mammalian somatic cell nuclear transfer has achieved great accomplishments through the past few decades' development.However，the limitations of industrialization of nuclear transfer are cumbersome technology as well as expensive equipments and unsatisfied with the efficiency of nuclear transfer.In recent years scientists applied a novel somatic cell cloning method，which called handmade somatic cell cloning（HCM）.Zona-free procedure may offer a solution for the latter problem.It is unnecessary micromanipulation for handmade somatic cell cloning and workers don' t require many skills.This technology is not only simplified the operation but also improved the efficiency of somatic cell nuclear transfer，which will advance the development and the industrialization of nuclear transfer to improve the efficiency of somatic cell nuclear transfer in future.This review will from the research progresses on HMC to explore the effects of handmade cloning factors and in order to optimize the handmade cloning technology.

Key words：Oocyte；Handmade cloning；Zona-free oocytes；Nuclear transfer

自Briggs and King（1952）[1]等人手工操作成功地將兩棲類美洲豹蛙（leopard frog）卵母細(xì)胞去核以來(lái)，科研者不斷地完善哺乳動(dòng)物的核移植技術(shù)。1997年，英國(guó)《自然》期刊報(bào)道了Wilmut 等[2]利用綿羊乳腺細(xì)胞進(jìn)行核移植實(shí)驗(yàn)，首次獲得世界上第一只克隆綿羊Dolly。這一開(kāi)創(chuàng)性的實(shí)驗(yàn)證實(shí)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞具有全能性，為后續(xù)開(kāi)展的體細(xì)胞核移植提供理論基礎(chǔ)。在此之后科學(xué)家利用哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)先后成功克隆出豬[3]、牛[4]、兔[5]、小鼠[6]、馬[7]等多種哺乳動(dòng)物，其中在2017年我國(guó)科學(xué)家首次成功完成克隆猴-“中中”和“華華”。然而核移植克隆的后代表現(xiàn)出體弱，生存力不強(qiáng)易致病死亡甚至出現(xiàn)衰老跡象[8-9]等特征，這些原因還有待進(jìn)一步研究。Vajta等[10]認(rèn)為傳統(tǒng)的核移植技術(shù)存在著種種缺陷，無(wú)法滿足克隆技術(shù)向規(guī)?；l(fā)展，其原因?yàn)椋海?）核移植效率低；（2）需要昂貴的設(shè)備以及熟練的技術(shù)操作（3）移植后妊娠率低，出生后死亡率高。1964年Gwatkin.R發(fā)現(xiàn)小鼠囊胚的透明帶暴露于酸性溶液時(shí)可以被溶解。研究學(xué)者開(kāi)始嘗試用無(wú)透明帶卵母細(xì)胞受精進(jìn)行囊胚發(fā)育，研究表明透明帶并非胚胎發(fā)育所必需的。Peura等[11]首次研究報(bào)道，牛的克隆成功應(yīng)用去核卵且無(wú)透明帶的卵母細(xì)胞與2-cell卵裂球融合。同時(shí)微穴法（well of the well，WOW）[11] 發(fā)展完備培養(yǎng)系統(tǒng)為無(wú)透明帶的重構(gòu)胚單個(gè)培養(yǎng)提供可能。Vajta 等[10]改進(jìn)Peura方法不依靠顯微設(shè)備，首次以體細(xì)胞為供體，將無(wú)透明帶核移植技術(shù)成功應(yīng)用于克隆牛。這一革新的核移植技術(shù)便是手工克隆技術(shù)（Handmade Somatic Cell Cloning，HCM），利用這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)成功得到了牛[10]、小鼠[13]、豬[14]、馬[15]、綿羊[16]等哺乳動(dòng)物核移植后代。此后，科研人員不斷完善手工克隆技術(shù)，使核移植效率提高，操作程序更簡(jiǎn)化，實(shí)驗(yàn)耗資少，使大規(guī)模開(kāi)展哺乳動(dòng)物核移植研究成為可能。本文著重從手工克隆技術(shù)操作，以及限制手工克隆成功因子等方面進(jìn)行論述，以期進(jìn)一步優(yōu)化手工克隆技術(shù)。

1 手工切割卵母細(xì)胞去核

1.1 卵母細(xì)胞去透明帶 將獲取得到的未成熟的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟（IVM），以卵母細(xì)胞排出第一極體為成熟標(biāo)志。然后用移液槍反復(fù)吹打成熟卵母細(xì)胞吹散粘連的顆粒細(xì)胞。選取外膜完整胞質(zhì)充滿成熟的卵母細(xì)胞移入鏈酶蛋白酶（Pronase E）微滴中。去透明帶一般需要5～10min左右，當(dāng)觀察到大多數(shù)卵母細(xì)胞開(kāi)始變形時(shí)迅速轉(zhuǎn)至T20（20%胎牛血清的TCM-199基礎(chǔ)液）清洗終止消化，最后將無(wú)透明帶的卵母細(xì)胞移至細(xì)胞松弛素（Cytochalasin B，CB）微滴中，然后放置37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育20min。Vajta[17]等將成熟的牛卵母細(xì)胞用CB 2.5ug/ml+T20處理后并在特定的位置切割細(xì)胞，其后期胚胎正常發(fā)育率高達(dá)90%以上。

1.2 卵母細(xì)胞去核 卵母細(xì)胞去核方法有多種，主要有盲吸去核法、DNA染色熒光去核法、化學(xué)藥物誘導(dǎo)去核法等，但大部分都要借助顯微操作儀才能完成去核。杜衛(wèi)華等研究利用藥物誘導(dǎo)小鼠卵母細(xì)胞的化學(xué)去核，其去核率與盲吸法去核無(wú)顯著差異。Peura等采用手工切割卵母細(xì)胞與Hoechst33342熒光染色去核技術(shù)相結(jié)合可獲得90%的去核率。Westhusin等實(shí)驗(yàn)表明Hoechst33342染色和紫外線（UV）短時(shí)間照射不會(huì)影響體細(xì)胞在去核卵母細(xì)胞發(fā)育的全能性。此后實(shí)驗(yàn)室手工克隆基本采用westhusin方法。將自制的特殊的切割刀片[18]或玻璃針小心將固定的卵母細(xì)胞切割兩半，也可以將切割工具安裝在顯微操作臂上，通過(guò)顯微操作儀將卵母細(xì)胞切割去核。卵母細(xì)胞恢復(fù)后使用Hoechst33342進(jìn)行DNA染色，通過(guò)顯微鏡的紫外光線短暫照射將含有細(xì)胞核的卵細(xì)胞去除，無(wú)核的胞質(zhì)卵保留。

2 供體細(xì)胞核來(lái)源

供體細(xì)胞核來(lái)源可以從胚胎發(fā)育過(guò)程的各個(gè)階段獲取如原核受精卵、胚胎的卵裂球（ES細(xì)胞）、胎兒細(xì)胞、分化成熟的體細(xì)胞等。近年的實(shí)驗(yàn)表明，作供體細(xì)胞重構(gòu)胚的早期的ES細(xì)胞要優(yōu)于成纖維細(xì)胞構(gòu)建的重組胚發(fā)育潛力。這進(jìn)一步揭示，供體細(xì)胞的來(lái)源其細(xì)胞核分化的程度越低，構(gòu)建的重構(gòu)胚發(fā)育潛力越高。當(dāng)前研究認(rèn)為核移植的成功率低，大多歸因于未能完全再程序化供體細(xì)胞中的后成性基因印記[19]，因此，為提高核移植成功率，均注重供體細(xì)胞來(lái)源的選擇。另有研究發(fā)現(xiàn)，供體動(dòng)物的年齡、供體細(xì)胞的類型、供體細(xì)胞周期、體外培養(yǎng)傳代次數(shù)等諸多因素，均可能影響核移植的效率，但在HCM克隆方面還沒(méi)有系統(tǒng)研究。

3 重構(gòu)胚的融合/激活

卵母細(xì)胞的融合與激活是手工克隆技術(shù)關(guān)鍵的一步，電融合被廣泛的用于供體細(xì)胞核融合到受體胞質(zhì)中。它是將無(wú)核的胞質(zhì)卵與供體體細(xì)胞通過(guò)電融合的方法，分為一次融合法和二次融合法。

3.1 供體一半卵一半卵一次電融合法 一次融合指通過(guò)電融合同時(shí)將兩枚無(wú)核的半卵和一枚供核體細(xì)胞粘連在一起，其排列順序?yàn)椋簾o(wú)核半卵一無(wú)核半卵—供體細(xì)胞。其具體做法：將低密度的供體細(xì)胞懸浮液先移入植物凝集素（500ug/mL PHA）操作液中，再將無(wú)核的半卵移入，進(jìn)行無(wú)核半卵一無(wú)核半卵—供體細(xì)胞粘和，然后進(jìn)行電融合，在穩(wěn)定電壓自動(dòng)排序。譚世儉等在牛的重構(gòu)胚融合，融合效率達(dá)到（95.68±3.97%）[20]。

3.2 半卵—供體—半卵二次電融合法 兩次融合指一枚無(wú)核半卵先與供體細(xì)胞融合，融合后的半卵再與另一枚無(wú)核半卵進(jìn)行融合。根據(jù)Vajta等研究報(bào)道，經(jīng)過(guò)兩次融合，其重構(gòu)胚的融合效率達(dá)到76%。

3.3 重構(gòu)胚的激活 當(dāng)精子進(jìn)入卵母細(xì)胞過(guò)程中，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞某些化學(xué)變化而使其處于激活的狀態(tài)。激活后的卵母細(xì)胞開(kāi)始胚胎發(fā)育，HCM胚胎發(fā)育也需要像精子激活卵母細(xì)胞一樣發(fā)育。2001年Vajita等人，通過(guò)電脈沖進(jìn)行HMC胚胎的激活。目前激活的方法主要有化學(xué)激活和電激活，研究者常用乙醇作為HCM胚胎的激活劑，將融合后的卵母細(xì)胞置于7%乙醇的微滴中培養(yǎng)60～90min以此來(lái)激活HMC胚胎。羅光彬等采用8%乙醇處理卵母細(xì)胞10min，CB+6-DAMP處理7h，卵裂率為40%左右。Kragh等[21]利用HMC技術(shù)使用化學(xué)激活和電激活相結(jié)合的方法進(jìn)行豬的體細(xì)胞核移植時(shí)，激活率為（49±1）%。

4 HCM重構(gòu)胚的培養(yǎng)

激活后無(wú)透明帶卵母細(xì)胞培養(yǎng)條件不同于傳統(tǒng)的胚胎培養(yǎng)方法。它要求培養(yǎng)的條件要相對(duì)獨(dú)立，避免胚胎間相互粘連，因此無(wú)透明帶核移植重構(gòu)胚需要單卵培養(yǎng)。研究者使用共培養(yǎng)或加入有利胚胎發(fā)育的生長(zhǎng)因子的方法來(lái)進(jìn)行獨(dú)立培養(yǎng)，然而其發(fā)育效果要低于群卵培養(yǎng)。許多培養(yǎng)基用于哺乳動(dòng)物胚胎的培養(yǎng)，例如小鼠的胚胎可在Whitten培養(yǎng)基培養(yǎng)，Brachett and Oliphant等以BO 培養(yǎng)基作為兔子胚胎的培養(yǎng)液。合成輸卵管液（The synthetic oviduct fluid medium，mSOF）被廣泛的用于牛胚胎的培養(yǎng)。

4.1 WOW培養(yǎng)系統(tǒng) WOW培養(yǎng)系統(tǒng)（The well of the well（WOW）system）是在Vajta研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。將毛細(xì)玻璃管頂端灼燒制成小圓玻璃球（直徑約為0.5～1mm），微熱時(shí)立即壓入細(xì)胞培養(yǎng)皿底部，利用余熱可在培養(yǎng)皿底部形成500μm以上圓形微孔。利用WOW系統(tǒng)培養(yǎng)法，Taka等[22]分別采用了內(nèi)徑為500μm和1000μm的圓形微孔培養(yǎng)單精注射的豬受精卵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)徑為1000μm的WOW有較高的囊胚率（24.6%）。

4.2 微囊培養(yǎng)法 根據(jù)Adinaya等[23]報(bào)道進(jìn)行改進(jìn)，其制作方法：在10#的注射器內(nèi)，將胚胎和海藻酸鈉溶液混合，通過(guò)推動(dòng)活塞將混合的胚胎從針頭流出時(shí)，液滴被同方向的氣體吹落至含氯化鋇溶液中，發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而形成凝膠，該方法制作的微囊直徑大約是0.5～10mm。Cosby等將無(wú)透明帶胚胎用海藻酸鈉包裹以微囊培養(yǎng)法培養(yǎng)，無(wú)透明帶胚胎囊胚發(fā)育率低于完整透明帶胚胎的囊胚發(fā)育率。

5 限制HCM操作成功的因子

5.1 不同哺乳動(dòng)物最適Pronase E濃度 去除卵母細(xì)胞透明帶的方法有許多種，現(xiàn)階段主要用酸性臺(tái)氏液法與鏈酶蛋白（Pronase E）法。高源等報(bào)道，發(fā)現(xiàn)去除透明帶使用酸性臺(tái)氏液法和0.5%鏈酶蛋白酶法對(duì)小鼠早期胚胎處理兩者沒(méi)有差異。目前HCM操作使用的主要是鏈酶蛋白酶法，豬的去除透明帶Pronase E濃度是在3.3mg/ml[24]。Vajta等[25-26]以濃度為1.5～2.0mg/ml Pronase E應(yīng)用在牛上。

5.2 供體細(xì)胞與受體卵母細(xì)胞的細(xì)胞周期的同步 核移植中無(wú)核的受體卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)儲(chǔ)存大量的能量、mRNA及各種生長(zhǎng)因子，這些物質(zhì)為早期胚胎發(fā)育提供了一切必需的原料。目前哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆的受體胞質(zhì)是MⅡ期卵母細(xì)胞。特別是供體核進(jìn)入母體胞質(zhì)關(guān)鍵期，胚胎發(fā)育完全依賴母源性物質(zhì)，因此受體胞質(zhì)質(zhì)量決定著胚胎發(fā)育，然而核移植操作過(guò)程中胞質(zhì)的溶液損失又是很難克服的。有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，受體卵母細(xì)胞胞質(zhì)的過(guò)多或過(guò)少，都會(huì)影響核移植重組胚的囊胚細(xì)胞數(shù)及其體外發(fā)育率。因此手工克隆切割細(xì)胞時(shí)要求盡量減少受體胞液外流。供體細(xì)胞同步化是無(wú)血清培養(yǎng)液處于G0/G1期細(xì)胞作為供體細(xì)胞核。Renard等研究表明，經(jīng)過(guò)“饑餓”處理的胎兒成纖維細(xì)胞能夠獲得高的克隆成功率。

5.3 去透明帶胚胎的問(wèn)題 透明帶（zona pelluccida，ZP）是一層包繞在所有哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞外圍的非細(xì)胞糖蛋白結(jié)構(gòu)，對(duì)卵子的發(fā)育、受精以及著床前胚胎發(fā)育起著關(guān)鍵性作用。正常發(fā)育的早期胚胎都有透明帶，在體內(nèi)透明帶可抵御細(xì)菌，白細(xì)胞或免疫學(xué)攻擊，在體外它可以抵御培養(yǎng)基內(nèi)的有毒物質(zhì)及細(xì)菌。有研究報(bào)道指出，在胚胎體外培養(yǎng)條件下，透明帶不是胚胎發(fā)育至關(guān)重要的。HCM去透明帶胚胎可能會(huì)受到培養(yǎng)基內(nèi)有害物質(zhì)的影響，胚胎的發(fā)育受到阻滯。Elsheikhet等通過(guò)人工構(gòu)建透明帶來(lái)解決這些問(wèn)題。

總之，手工克隆較傳統(tǒng)核移植克隆技術(shù)操作程序要簡(jiǎn)單，不需要昂貴的操作儀器，對(duì)克隆感興趣的任何人都可以在簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作完成。目前HCM方法獲得克隆動(dòng)物還不多，但已經(jīng)在具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值動(dòng)物類克隆上取得了成就，豬、綿羊以及小鼠已先后用HCM克隆出。相信在未來(lái)將有更好的HCM克隆程序被應(yīng)用于具有優(yōu)良基因的動(dòng)物繁殖，挽救瀕危動(dòng)物，以及開(kāi)發(fā)具有醫(yī)藥價(jià)值的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育。因此哺乳動(dòng)物HCM克隆將會(huì)在未來(lái)商業(yè)化規(guī)?；M(jìn)程中發(fā)揮重要的作用。

參考文獻(xiàn)

[1]BriggsR，King TJ.Transplantation of living cell nuclei from blastula cells into enucleated frog egg[J].Proc.Natl Acad Sci，1952（38）：455-463.

[2]I.Wilmut，A.E.Schnieke，J.McWhir，et al Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells[J].Nature，1997（385）：810-813.

[3]Polejaeva IA，Chen SH，Vaught TD，et al.Cloned Pigs Produced by nuclear transfer from adult somatic cells[J].Nature，2000（407）：86-90.

[4]Robl JM，Prather R，Barnes F，et al Nuclear transplantation in bovine embryos[J].Anil Sci，1987（64）：642-647.

[5]Patrick Chesné1，Pierre G.Adenot1，et al Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells[J].Nature Biotechnology.2002，20（4）：366-369.

[6]Kono T，Tsunoda Y.Nuclear transplantation in rat embryos[J].ExP Zool.1988，284：303-305.

[7]Cesare Galli，Irina Lagutina，Gabriella Crotti，et al Pregnancy：A cloned horse born to its dam twin[J].Nature，2003，424（6949）：635.

[8]Hill，Cibelli，Roussel，et al Clinical and pathologic features of cloned transgenic calves and fetuses（13 case studies）[J]. Therio，1999（51）：1451-1465.

[9]Cibelli J B，Campbell K H，Seidel G E，et al.The healt profile of cloned animals[J]. Nature Biotech，2002（20）：13-14.

[10]Vajta，Ian M，Poul H，et al Somatic cell cloning without micromanipulators cloning[J].Cloning，2001（3）：89-95.

[11]Peura TT，Lewis I.M，Trounson A.O. The effect of recipient oocyte volume on nuclear transfer in cattle[J].Mol Reproduce Dev，1988（50）：185-191.

[12]Vajta G，Peura TT，Holm P，et al.New method for culture of zona-icluded or zona-free embryos：the Well of the Well（WOW）system[J].Mol Reproduce Dev，2000（55）：256-264.

[13]Ribas R，Oback B，Ritchie W，et al.Development of a zona-free method of nuclear transfer in the mouse[J].Cloning Stem Cells，2005（7）：126-138.

[14]Du Y，Zhang Y，Li J et al. Piglets born from handmade cloning[J].Reproduce Fertile，2007，19：135.

[15]Lagutina I，Lazzari G，Duchi R，et al.Somatic cell nuclear transfer in horse；effect of oocyte morphology，embryo reconstruction of method and donor cell type[J].Reproduction，2005（4）：559-567.

[16]Lagutina I，Lazzari G，Duchi R，et al.Comparative aspects of Somatic cell nuclear transfer with conventional and zona-free method in cattle，horse，pig and sheep[J].Theriogenology，2007（1）：90-98.

[17]Vajta，Ian M Alan O，et al. Handmade Somatic Cell Cloning in Cattle：Analysis of Factors Contributing to High Efficiency in Vitro[J].Biology of Reprod，2003（68）：571-578.

[18]黃章虎，任艷萍，譚世儉等徒手克隆工具的自制及改進(jìn)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011（5）：237-240.

[19]Rideout W M，Eggan K，Jaenisch R.Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome[J].Science，2001（293）：1093-1098.

[20]譚世儉，Qion L M，石德順.牛去透明帶卵體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用研究[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2003（3）：201-206.

[21]Kragh PM，Du Y，Corydon TJ，et al.Efficient in vitro production of porcine blastocysts by handmade cloning with a combined electrical and chemical activation[J].Theriogenology，2007（1）：90-98.

[22]TaKa M，Iwayama H，F(xiàn)ukui Y，et al.Effect of the well of the well（WOW）system on in vitro culture for porine embryos after intracytoplasmic sperm injection[J]. Journal of Reproduction and Development，2005（51）：533-537.

[23]Adinaya G.K，Rawlins RJ，Miller IF，et al.Effect of sodium alginate encapsulation on the development of preimplantation mouse embryos [J].In Vitro Fertil Embryo Transfer，1987（4）：343-345.

[24]王獻(xiàn)偉，韓露，等.豬手工克隆胚胎生產(chǎn)程序[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014（6）：69-71.

[25]Vajta，Ian M，R.Tayfur.Tecirlioglu.Handmade Somatic Cell Cloning in Cattle[J].Methods in molecular biology，2006（68）：571-578.

[26]Vajta，Ian M，Alan O，et al.Handmade Somatic Cell Cloning in Cattle：Analysis of Factors Contributing to High Efficiency in Vitro[J].Biology of reproduction，2003（68）：571-578.

（責(zé)編：王慧晴）