卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的改進(jìn)策略

吳銳，黃官友，趙淑云

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，貴陽 550001)

輔助生殖技術(shù)(ART)是治療不孕不育的主要方法，高質(zhì)量的成熟卵母細(xì)胞是決定ART成功的關(guān)鍵因素之一。在不孕女性，特別是多囊卵巢綜合征(PCOS)患者及卵巢低反應(yīng)人群中，不成熟的卵母細(xì)胞較為多見，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞的利用率與ART的成功率大幅下降。為此，卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。IVM技術(shù)的應(yīng)用不僅能提高卵母細(xì)胞的利用率，還有利于減少激素用量，降低過度刺激綜合征的發(fā)生風(fēng)險。此外，IVM技術(shù)在女性生育力保存方面具有較大的應(yīng)用前景。

從首次利用IVM與ART技術(shù)相結(jié)合的試管嬰兒成功誕生到2015年，全世界有超過2 000例的IVM試管嬰兒[1-2]。臨床數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)IVM處理后的卵母細(xì)胞成熟率低，發(fā)育潛能差。PCOS患者未成熟卵進(jìn)行IVM-IVF后其臨床妊娠率與著床率顯著低于采用常規(guī)IVF的PCOS患者[3]。因此，改善IVM技術(shù)、提高卵母細(xì)胞IVM成功率與卵母細(xì)胞質(zhì)量具有十分重要的臨床意義。本文就近年來對卵母細(xì)胞IVM進(jìn)行改善的策略進(jìn)行綜述，以期為人卵母細(xì)胞IVM技術(shù)進(jìn)一步完善、早日實現(xiàn)IVM技術(shù)在胚胎實驗室中作為常規(guī)使用提供幫助。

一、抗氧化劑的使用

由活性氧(ROS)引起的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致卵母細(xì)胞IVM成功率低下的重要原因之一。在體內(nèi)，卵母細(xì)胞的ROS水平相對穩(wěn)定；而在體外，卵母細(xì)胞缺少卵泡液等類似于體液的調(diào)節(jié)，其ROS平衡容易受到破壞。同時，體外操作、光照及培養(yǎng)環(huán)境的改變都容易產(chǎn)生ROS，破環(huán)線粒體功能，從而降低卵母細(xì)胞質(zhì)量。因此，在體外培養(yǎng)的培養(yǎng)液中添加抗氧化劑可以減少ROS，改善線粒體功能，從而提高卵母細(xì)胞的成熟率與發(fā)育潛能。

輔酶Q10是一種重要的抗氧化劑，也是線粒體呼吸鏈中關(guān)鍵的電子載體。Ma等[4]研究發(fā)現(xiàn)，高齡不孕女性的卵母細(xì)胞在進(jìn)行體外培養(yǎng)時添加輔酶Q10，不僅提高了卵母細(xì)胞的體外成熟率，也降低了成熟卵母細(xì)胞的非整倍體率。白藜蘆醇作為抗氧化劑，在改善高齡女性卵母細(xì)胞非整倍體與線粒體功能方面具有重要作用。一項關(guān)于白藜蘆醇是否改善高齡婦女與小鼠卵母細(xì)胞IVM結(jié)局的研究發(fā)現(xiàn)，添加1.0 μmol/L白藜蘆醇可顯著提高人與小鼠卵母細(xì)胞IVM后的極體排除率(即核成熟率)，同時提高小鼠卵母細(xì)胞的受精率與囊胚形成率[5]。褪黑素作為自由基的清除劑，可保護(hù)細(xì)胞免受ROS造成的損傷。同時，褪黑素在延緩卵巢衰老、調(diào)節(jié)黃體酮產(chǎn)生與預(yù)測卵巢儲備功能方面也發(fā)揮重要作用。在卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)周期獲取的GV期和MI期卵母細(xì)胞的培養(yǎng)液中分別加入1 nmol/L褪黑素，可以將IVM率分別提高至70%和90%[6]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，利用褪黑素進(jìn)行IVM所獲得的卵母細(xì)胞具有較好的發(fā)育潛能；RNA測序發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞的氧化磷酸化通路相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，線粒體膜電位與ROS水平也得到改善[7]。另有研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)液中添加褪黑素可降低因卵泡液褪黑素不足所導(dǎo)致的高齡女性卵母細(xì)胞非整倍體率[8]。在綠茶中發(fā)現(xiàn)的抗癌物質(zhì)茶多酚可有效清除氧自由基，有抗氧化作用。最新的研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚在改善豬卵母細(xì)胞的體外成熟和胚胎發(fā)育方面亦有重要作用[9]。

此外，還有不少具有抗氧化和防衰老的抗氧化劑在癌癥治療和卵母細(xì)胞老化中已有研究，或可同樣有利于卵母細(xì)胞的體外成熟。以上有關(guān)抗氧化劑的使用雖能有效促進(jìn)卵母細(xì)胞IVM和胚胎發(fā)育，但其對后續(xù)胚胎著床與胚胎安全的影響仍需要更多的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證，臨床使用仍需謹(jǐn)慎。

二、激素與生長因子的應(yīng)用

FSH和LH是調(diào)控卵泡發(fā)生和減數(shù)分裂進(jìn)程的兩種重要激素。2007年，有研究發(fā)現(xiàn)添加FSH和LH有助于卵丘細(xì)胞的擴(kuò)張和卵母細(xì)胞核成熟[10]。目前，大多數(shù)用于研究卵母細(xì)胞IVM的培養(yǎng)液都已添加FSH與LH，以期提高卵母細(xì)胞IVM率。

生長激素作為經(jīng)典的多效性肽段激素，已有臨床研究表明可用于治療女性不孕。生長激素治療可提高卵巢正常反應(yīng)的不孕女性的胚胎種植率和受孕率，而對卵巢低反應(yīng)、高齡或多次IVF周期失敗的女性，生長激素治療可提高已獲取的卵母細(xì)胞的成熟比例、2PN率和可移植胚胎數(shù)[11-15]。體內(nèi)注射生長激素還有助于提高人GV期卵母細(xì)胞的IVM率[16]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在IVM培養(yǎng)基中添加生長激素可提高卵母細(xì)胞IVM率；成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行ICSI后，受精率與囊胚形成率也顯著升高；RNA測序發(fā)現(xiàn)添加生長激素組的成熟卵母細(xì)胞中與減數(shù)分裂和胚胎發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)水平都顯著升高[17]。

LH下調(diào)卵母細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平是促使卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂的關(guān)鍵。在卵巢卵泡內(nèi)，LH并不直接作用于卵母細(xì)胞，而是通過C型鈉尿肽/鈉尿肽受體2(CNP/NPR2)系統(tǒng)與表皮生長因子(EGF)及其受體形成的信號通路降低卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP水平。EGF信號通路不僅參與LH信號傳導(dǎo)，而且在顆粒細(xì)胞功能、卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物代謝、卵母細(xì)胞成熟與發(fā)育潛能等多方面發(fā)揮重要作用[18]。卵母細(xì)胞IVM過程使EGF信號通路被破環(huán)，如果添加EGF樣肽段(如AREG、EREG、BTC等)，則有助于改善卵丘細(xì)胞擴(kuò)展、卵母細(xì)胞MⅡ率、卵裂率、囊胚形成率、囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)目以及囊胚著床率[18]。最近，在一項利用小鼠模型研究影響高齡女性卵母細(xì)胞質(zhì)量的生長因子的研究中，科研人員發(fā)現(xiàn)胰島素生長因子(IGF2)在老年小鼠卵泡和卵母細(xì)胞的表達(dá)水平都顯著下降。但如果在卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)液中添加IGF2，則極大提高了卵母細(xì)胞的成熟率，改善了卵母細(xì)胞的紡錘體形成與線粒體功能，囊胚形成率也從41%提高至64%[19]。

三、卵泡液的使用

卵泡液是卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟的重要微環(huán)境。卵母細(xì)胞在減數(shù)分裂GV期的停滯及減數(shù)分裂的重啟都與卵泡液密切相關(guān)。卵泡液中的物質(zhì)，如cAMP、FSH等可以通過壁顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至卵母細(xì)胞，維持卵母細(xì)胞內(nèi)高水平的cAMP，抑制促成熟因子(MPF)的生物學(xué)活性，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞停滯在減數(shù)分裂GV期；隨著卵泡液中LH峰的出現(xiàn)，卵母細(xì)胞與卵泡液中的環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)水平降低，磷酸二酯酶活性升高，從而導(dǎo)致cAMP水平降低，減數(shù)分裂恢復(fù)[20]。另外，卵泡液成分或所占比重在原始卵泡激活、次級卵泡生長與卵母細(xì)胞成熟等不同階段各不相同，優(yōu)化各個階段的卵泡液成分比例，有助于提高卵母細(xì)胞IVM率與卵母細(xì)胞質(zhì)量。在卵泡激活與生長階段，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)與mTOR復(fù)合物1(mTORC1)兩條信號通路是主要的調(diào)控途徑。使用激活劑激活mTOR或PI3K信號通路有助于改善早發(fā)性卵巢功能不全(POI)患者的ART治療結(jié)局[21]。目前大多數(shù)研究都表明，卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞的相互作用是卵泡激活與發(fā)育的關(guān)鍵。例如，在卵泡體外培養(yǎng)(IVC)系統(tǒng)中添加卵母細(xì)胞分泌的生長分化因子-9(GDF-9)或骨形態(tài)因子-15(BMP-15)可促進(jìn)原始卵泡的激活[22]。在卵泡體外生長階段添加200 ng/ml 堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，抑制竇前卵泡的凋亡，從而有利于卵巢早期卵泡的發(fā)育[23]。

PCOS患者對激素調(diào)控的卵巢反應(yīng)與其他不孕女性不同，容易出現(xiàn)卵巢過度刺激，且卵母細(xì)胞成熟率低、質(zhì)量差，這可能與卵泡液成分含量變化相關(guān)。在一項PCOS女性卵母細(xì)胞IVM的研究中，研究人員比較了PCOS患者來源的未成熟卵母細(xì)胞在四個不同處理組的IVM結(jié)局：A組為直接IVM，B組為添加自身來源的卵泡液進(jìn)行IVM，C組為添加正常卵泡液進(jìn)行IVM，D組為添加正常卵泡液和卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物進(jìn)行IVM。卵母細(xì)胞IVM率依次為D組>C組>A組>B組，且D組的卵母細(xì)胞受精后卵裂率最高。此結(jié)果表明，添加優(yōu)質(zhì)卵泡液可改善卵母細(xì)胞的IVM率，而劣質(zhì)的卵泡液會抑制卵母細(xì)胞的IVM[24]。

四、顆粒細(xì)胞的使用

顆粒細(xì)胞是卵泡內(nèi)除卵母細(xì)胞外的主要細(xì)胞，包括卵泡邊緣的壁顆粒細(xì)胞和包裹卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞。顆粒細(xì)胞通過與卵母細(xì)胞的連接將卵泡液中的營養(yǎng)物質(zhì)與生物信號傳遞到卵母細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的發(fā)育與成熟。LH峰下調(diào)卵母細(xì)胞cAMP水平是體內(nèi)促使卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂的主要環(huán)節(jié)。研究表明，LH可以與壁顆粒細(xì)胞表達(dá)的LH受體結(jié)合，通過壁顆粒細(xì)胞的旁分泌途徑向卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞傳遞信號，最終完成LH信號通路。目前已鑒定發(fā)現(xiàn)的24個LH信號通路分子中有10種蛋白質(zhì)由顆粒細(xì)胞表達(dá)，包括5種顆粒細(xì)胞蛋白(LH受體、腺苷酸環(huán)化酶7/9、C型鈉尿肽、表皮生長因子、雙調(diào)蛋白)和5種卵丘細(xì)胞蛋白(鈉尿肽受體2、eRB1、Cx43、BMPRII、SMAD2/3)[25]。因此，將卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)可能有助于提高卵母細(xì)胞的IVM率。

在將豬的卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)時，能獲得與卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物培養(yǎng)相近的IVM率，而且進(jìn)行ICSI受精后卵裂率與囊胚形成率高于IVF受精組，提示IVM獲得的成熟卵母細(xì)胞采用ICSI受精方式的妊娠結(jié)局更理想[26]。在小鼠卵母細(xì)胞IVM過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)，與將未成熟卵母細(xì)胞直接IVM或與卵巢組織共培養(yǎng)相比，與卵丘細(xì)胞復(fù)合物共培養(yǎng)可顯著提高卵母細(xì)胞的體外成熟率與囊胚形成率[27]。為了避免顆粒細(xì)胞易污染和操作復(fù)雜的缺點(diǎn)，白曉紅等[28]將顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液與IVM液按1∶1進(jìn)行配制，用于體外培養(yǎng)小鼠未成熟卵母細(xì)胞，結(jié)果表明，顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液雖然對卵母細(xì)胞成熟無顯著影響，但有利于成熟卵母細(xì)胞受精率和囊胚形成率的提高。在人未成熟卵母細(xì)胞的IVM中，惠董娜等[29]發(fā)現(xiàn)添加顆粒細(xì)胞復(fù)合物顯著提高GV期和MI期卵母細(xì)胞的IVM率，同時有利于MI期來源的成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，而對GV期來源的成熟卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的改善尚不能確定。

五、卵母細(xì)胞IVM前的培養(yǎng)

研究表明，卵母細(xì)胞IVM成功率低與各生殖中心用于IVM的未成熟卵母細(xì)胞的不均一性有關(guān)[30]。大部分生殖中心用于IVM的未成熟卵母細(xì)胞是卵泡經(jīng)過HCG刺激后獲得的，而小卵泡(<12 mm)在經(jīng)過HCG刺激后，卵母細(xì)胞的發(fā)育階段不同，包括MⅡ期、MI期、GV期等。為了保證卵母細(xì)胞的同質(zhì)性，研究人員對PCOS患者采用短暫的FSH刺激而不注射HCG的方案進(jìn)行促排卵，所得卵母細(xì)胞能獲得約50%的IVM率[31]。另外，體內(nèi)卵母細(xì)胞在卵泡內(nèi)受到cAMP的調(diào)節(jié)，使得減數(shù)分裂停止在GV期，而體外的卵母細(xì)胞由于cAMP水平下降，易自發(fā)恢復(fù)減數(shù)分裂，導(dǎo)致卵母細(xì)胞核與質(zhì)出現(xiàn)不同步成熟[32-33]。為實現(xiàn)IVM卵母細(xì)胞的發(fā)育同步，研究人員最初考慮利用cAMP磷酸二酯酶抑制劑(PDE3-I)維持卵母細(xì)胞體外的減數(shù)分裂停滯，從而增強(qiáng)其發(fā)育潛能，但去除PDE3-I后并不能成功恢復(fù)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂[34]。后來研究人員發(fā)現(xiàn)卵丘細(xì)胞表達(dá)的C型利尿鈉肽(CNP)不僅能有效維持未成熟卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂停滯，且去除后容易恢復(fù)減數(shù)分裂，同時還能有效維持卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞間連接[35]。于是有研究人員利用CNP進(jìn)行牛卵母細(xì)胞IVM前培養(yǎng)處理，極大提高了卵母細(xì)胞發(fā)育潛能與胚胎質(zhì)量[36]。在小鼠模型中，Romero等[37]也發(fā)現(xiàn)，對包裹卵丘細(xì)胞的未成熟卵進(jìn)行成熟前培養(yǎng)(PMC)/IVM時添加CNP顯著提高IVM成功率。不僅如此，Zhao等[38]發(fā)現(xiàn)，PMC進(jìn)行24 h可顯著提高卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展，有利于卵丘擴(kuò)展與EGF信號通路相關(guān)基因的高效表達(dá)，以及卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物的三磷酸腺苷(ATP)與二磷酸腺苷(ADP)含量增加。同時，與對照IVM相比，PMC/IVM后的卵母細(xì)胞受精后其囊胚形成率增加約50%。Sánchez等[39]首先發(fā)現(xiàn)，對PCOS女性小卵泡(2～8 mm)來源的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物先利用CNP進(jìn)行PMC，隨后在含有FSH和雙調(diào)蛋白(AREG)的培養(yǎng)液中體外成熟。該方法獲得卵母細(xì)胞體外成熟率高達(dá)70%，顯著高于常規(guī)IVM成功率(49%)。此外，研究人員利用CNP進(jìn)行PMC/IVM對婦科腫瘤患者卵巢來源的卵母細(xì)胞進(jìn)行IVM，也獲得了較好的成熟率(56%)，顯著高于對照組IVM 的成熟率(35%)，表明此方法在女性生育力保存方面具有較好的應(yīng)用價值[40]。值得注意的是，以上研究均對卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物進(jìn)行PMC/IVM顯示有效，而PMC/IVM對單獨(dú)卵母細(xì)胞的IVM是否有效有待研究。

綜上所述，卵母細(xì)胞IVM技術(shù)策略的改進(jìn)主要參考卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟環(huán)境及調(diào)控機(jī)制的完善程度，目前已可以基本滿足ART的要求，但其胚胎移植后的臨床結(jié)局研究報道相對較少。同時，卵母細(xì)胞IVM技術(shù)的完善與臨床應(yīng)用尚有幾個方面需要注意：IVM技術(shù)并不適用于所有未成熟卵母細(xì)胞(如遺傳因素導(dǎo)致的成熟障礙)；仍需要更多的臨床數(shù)據(jù)加以證實IVM改進(jìn)方法的可行性；非體內(nèi)天然存在的抗氧化劑對胚胎發(fā)育后續(xù)的影響尚不確定，所以其使用需要謹(jǐn)慎；卵母細(xì)胞與卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物、GV期與MI期的未成熟卵母細(xì)胞采取的IVM方式應(yīng)有所區(qū)別。

卵母細(xì)胞IVM技術(shù)的完善與應(yīng)用對提高ART成功率意義重大。相信隨著卵母細(xì)胞成熟調(diào)控機(jī)制的研究不斷深入、臨床探索更加全面，卵母細(xì)胞IVM技術(shù)也將很快在ART中廣泛開展。