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    外源褪黑素對豬卵母細(xì)胞體外成熟及多精受精的影響

    2022-04-15 07:17:18劉佳慧姜希卿張琪王博琳張吉龍金君學(xué)孫婧陶
    中國畜牧雜志 2022年4期
    關(guān)鍵詞:體外受精影響

    劉佳慧,姜希卿,張琪,王博琳,張吉龍,金君學(xué)*,孫婧陶*

    (1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030;2.黑龍江省動物細(xì)胞與遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

    多精受精是指受精過程中,有2個或2個以上精子進(jìn)入卵母細(xì)胞的現(xiàn)象。與體內(nèi)受精相比,體外受精時多精受精的發(fā)生率增高,導(dǎo)致早期胚胎死亡、發(fā)育異常/阻滯等現(xiàn)象發(fā)生。豬物種在體外環(huán)境下多精受精發(fā)生率高達(dá)50%~90%,是研究多精受精的理想模型。卵母細(xì)胞成熟包括核成熟和質(zhì)成熟。第二次減數(shù)分裂中期第一極體排出是核成熟的標(biāo)志。胞質(zhì)成熟是指各種細(xì)胞內(nèi)事件,如能量調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)累積、細(xì)胞器(皮質(zhì)顆粒、高爾基體)重排等。然而,在卵母細(xì)胞體外成熟過程中,細(xì)胞核率先成熟,卵母細(xì)胞質(zhì)成熟的延遲使皮質(zhì)顆粒的遷移及胞吐受到抑制,導(dǎo)致多精受精發(fā)生。因此,通過改善卵母細(xì)胞的質(zhì)成熟將有效地抑制多精受精。

    褪黑素作為一種強(qiáng)抗氧化劑,在卵母細(xì)胞體外成熟過程中可降低活性氧水平,保護(hù)卵母細(xì)胞免受氧化損傷的侵害;同時,還可以促進(jìn)卵母細(xì)胞脂質(zhì)代謝、改善線粒體功能,從而有效改善卵母細(xì)胞體外成熟的效率。然而,迄今為止,關(guān)于褪黑素在豬卵母細(xì)胞多精受精中的作用鮮有報(bào)道。本研究擬通過在豬卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加褪黑素,檢測卵母細(xì)胞體外成熟率、多精受精發(fā)生率及與多精受精相關(guān)的細(xì)胞器分布情況,以期探討褪黑素對豬卵母細(xì)胞多精受精的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究所有實(shí)驗(yàn)試劑均購置于Sigma(美國)公司,特殊說明的除外。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 豬卵母細(xì)胞的收集與體外培養(yǎng) 從華欣眾貿(mào)肉業(yè)有限公司屠宰場獲得豬卵巢,置于25~30℃含青霉素和鏈霉素的生理鹽水中,2 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用18 號針頭抽取直徑為3~6 mm 卵泡內(nèi)的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-oocyte Complexs,COCs)。經(jīng)洗卵液洗滌3次,在體式顯微鏡下挑取卵母細(xì)胞胞質(zhì)均勻且周圍包裹多層致密卵丘細(xì)胞的COCs,移入覆蓋礦物油的500 μL卵母細(xì)胞體外成熟(In vitro Maturation,IVM)培養(yǎng)液中培養(yǎng)21 h,再轉(zhuǎn)移至無激素(PMSG 和hCG)的IVM 培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)21 h,培養(yǎng)條件為38.5℃、5%CO飽和濕度環(huán)境。

    IVM 培養(yǎng)液采用TCM-199(Invitrogen)作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液,添加0.6 mmol/L 半胱氨酸,0.91 mmol/L丙酮酸鈉,10 ng/mL EGF,10% 豬卵泡液,10 IU/mL PMSG,10 IU/mL hCG,1%青鏈霉素(Invitrogen)。在IVM 培養(yǎng)液中,褪黑素組、褪黑素+Luzindole 組分別添加1 nmol/L 褪黑素、1 nmol/L 褪黑素+1 nmol/L Luzindole(選擇性褪黑素受體拮抗劑),不添加褪黑素及Luzindole 組作為對照組,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 卵母細(xì)胞體外受精及胚胎培養(yǎng) COCs 經(jīng)42 h 體外成熟后,使用0.05%透明質(zhì)酸酶去除卵母細(xì)胞周圍包裹的卵丘細(xì)胞,將成熟卵母細(xì)胞每15 枚置于25 μL 受精滴中。取1 mL 精液(精液由哈爾濱市雙城區(qū)富泉種豬廠提供)置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育15 min,2 000 r/min離心4 min;棄上清,加入1 mL DPBS,2000 r/min 離心4 min;棄上清,加入1 mL mTBM,重懸;按照500:1的精卵比稀釋精液。在受精進(jìn)行之前,要確保精子活力>80%。取25 μL 精液加入受精滴中,置于38.5℃、5%CO飽和濕度環(huán)境下孵育6 h 后,轉(zhuǎn)移至PZM3 胚胎培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 觀察卵裂率,168 h 觀察囊胚率。

    1.2.3 體外多精受精發(fā)生率的檢測 受精卵于PZM3 胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)10 h 后,移入0.2% PVA-PBS 中洗滌3 次,每次1~2 min;將受精卵移入0.1%濃鹽酸中,停留2~3 s,去除透明帶;置于0.2% PVA-PBS 中洗滌3 次,每次1~2 min;使用10 μg/mL Hoechst 33342 將無透明帶的受精卵室溫下染色5 min,0.2% PVA-PBS 中洗滌3 次,每次1~2 min;凡士林封片,于熒光顯微鏡(Nikon,80i)下觀察豬卵母細(xì)胞原核形成情況,統(tǒng)計(jì)多精受精發(fā)生率:雙原核為正常受精;3個以上原核為多精受精。

    1.2.4 皮質(zhì)顆粒染色 將成熟卵母細(xì)胞置于4% 多聚甲醛中固定30 min;用含0.3% BSA+1 mol/L 甘氨酸的PBS(封閉液)清洗3 次,每次5 min;卵母細(xì)胞移入含0.1% Triton-X100 的PBS 中通透5 min,使用封閉液清洗3 次,每次5 min;卵母細(xì)胞放置到100 μg/mL 的FITC-PNA(Sigma,L7381)中室溫避光染色30 min;凡士林封片,使用激光共聚焦顯微鏡(Leica,TCS SP8)觀察皮質(zhì)顆粒分布情況。皮質(zhì)顆粒正常分布率計(jì)算方法:各組正常分布的卵母細(xì)胞個數(shù)/各組卵母細(xì)胞總數(shù)。

    1.2.5 高爾基體染色 將成熟卵母細(xì)胞置于4%多聚甲醛中固定10 min,使用預(yù)冷的0.2% PVA-PBS 清洗3 次,每次1~2 min;卵母細(xì)胞移入5 mmol/L NBD C6-Ceramide(GeneCopoeia,C049)中,4℃ 避光染色30 min,使用預(yù)冷的0.2% PVA-PBS 清洗3 次,每次1~2 min;移入2%BSA-PBS 中室溫孵育60 min,使用預(yù)冷的0.2% PVAPBS 清洗3 次,每次1~2 min;凡士林封片,使用熒光顯微鏡觀察高爾基體分布情況。高爾基體正常分布率計(jì)算方法:各組正常分布的卵母細(xì)胞個數(shù)/各組卵母細(xì)胞總數(shù)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)分析 每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0 通過單因素方差分析(ANOVA)和Duncan's檢驗(yàn)進(jìn)行分析,結(jié)果使用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。<0.05 表示差異顯著。

    2 結(jié)果

    2.1 褪黑素對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響 由表1 可知,3 組之間卵母細(xì)胞成熟率無顯著性差異,即褪黑素處理未對豬卵母細(xì)胞核成熟率產(chǎn)生顯著影響。

    表1 褪黑素對豬卵母細(xì)胞體外成熟率的影響

    2.2 褪黑素對豬體外受精胚胎發(fā)育能力的影響 表2 顯示,各處理組卵裂率無顯著差異,但在培養(yǎng)168 h 后,褪黑素組的囊胚率顯著高于對照組和褪黑素+Luzindole組,后2 組間差異不顯著。

    表2 褪黑素對豬體外受精胚胎發(fā)育能力的影響

    2.3 褪黑素對豬卵母細(xì)胞多精受精發(fā)生率的影響 在胚胎培養(yǎng)10 h 后,檢測豬卵母細(xì)胞多精受精發(fā)生情況,如表3 所示,褪黑素組的多精受精率低于對照組及褪黑素+Luzindole 組(<0.05),雙原核胚胎形成率高于其他2 組(<0.05)。

    表3 褪黑素對豬卵母細(xì)胞多精受精發(fā)生率的影響

    2.4 褪黑素對成熟豬卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒分布情況的影響由圖1 可知,褪黑素組皮質(zhì)顆粒正常分布率高于對照組和褪黑素+Luzindole 組(<0.05)。

    圖1 褪黑素對成熟豬卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒分布情況的影響

    2.5 褪黑素對成熟豬卵母細(xì)胞高爾基體分布情況的影響由圖2 可知,褪黑素組高爾基體正常分布率高于對照組和褪黑素+Luzindole 組 (<0.05)。

    圖2 褪黑素對成熟豬卵母細(xì)胞高爾基體分布情況的影響

    3 討 論

    本研究于豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加褪黑素或褪黑素+Luzindole,檢測褪黑素對豬卵母細(xì)胞體外成熟及多精受精中的影響,結(jié)果顯示,各組間卵母細(xì)胞核成熟率無顯著差異,而褪黑素組多精受精率顯著下降,體外受精后囊胚形成率顯著提高,同時,卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒、高爾基體正常分布率顯著增加。

    3.1 褪黑素對豬卵母細(xì)胞體外成熟及胚胎發(fā)育的影響褪黑素作為重要的抗氧化劑,在卵母細(xì)胞體外成熟過程中發(fā)揮著極為重要的作用。有研究表明,在小鼠、牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中添加褪黑素可以明顯改善卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟能力,如改善線粒體功能,提高GSH、ATP 水平及抗氧化基因的表達(dá),改善DNA 損傷,調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞脂質(zhì)代謝,改善卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量等。本研究中,卵母細(xì)胞核成熟數(shù)據(jù)顯示,各組間核成熟率并無顯著性差異。在此前的研究中,He和Yaacobi-Artzi 等分別在小鼠和牛中也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果。而后,將成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精,發(fā)現(xiàn)褪黑素可顯著提高囊胚形成率,而在褪黑素及其拮抗劑Luzindole 共培養(yǎng)時,該現(xiàn)象被明顯抑制。據(jù)此推測,在豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中,添加外源褪黑素盡管未能提高核成熟率,但很有可能提高卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟能力,進(jìn)而改善體外受精胚胎的發(fā)育能力。

    3.2 褪黑素對豬卵母細(xì)胞多精受精的影響 據(jù)報(bào)道,卵母細(xì)胞的體外受精及胚胎發(fā)育能力與卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量密切相關(guān),但在體外成熟過程中,卵母細(xì)胞常常受到氧化應(yīng)激影響,導(dǎo)致核質(zhì)成熟不同步,即當(dāng)卵母細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)成熟相關(guān)因子如細(xì)胞器分布等積累到成熟標(biāo)準(zhǔn)之前,細(xì)胞核會率先成熟,致使卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量較差。當(dāng)質(zhì)量較差的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精時,阻止多精受精的屏障尚未建立完全,即皮質(zhì)反應(yīng)或透明帶反應(yīng)不充分。本研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可顯著提高豬卵母細(xì)胞體外受精后的雙原核胚胎率,同時顯著降低多精受精的發(fā)生率。本研究結(jié)果證實(shí)褪黑素可顯著降低豬卵母細(xì)胞多精受精的發(fā)生。

    3.3 褪黑素對豬卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒及高爾基體分布的影響 皮質(zhì)顆粒是受精前存在于卵母細(xì)胞質(zhì)膜下的皮質(zhì)層中的分泌小泡。在卵母細(xì)胞成熟過程中,皮質(zhì)顆粒數(shù)量不斷增加并逐漸向質(zhì)膜遷移,呈線狀排列,這是卵母細(xì)胞質(zhì)成熟的標(biāo)志之一。卵母細(xì)胞受精時,當(dāng)?shù)?個精子與卵母細(xì)胞融合,皮質(zhì)顆粒會發(fā)生胞吐作用,以防止其余精子與卵母細(xì)胞融合。卵母細(xì)胞體外受精過程中的多精受精率較高,一部分原因是由于皮質(zhì)顆粒未遷移至質(zhì)膜區(qū)域或皮質(zhì)顆粒數(shù)量較少,致使皮質(zhì)反應(yīng)不充分,從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞不能有效阻止多精入卵。本研究通過檢測皮質(zhì)顆粒在成熟卵母細(xì)胞中的分布情況,發(fā)現(xiàn)在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加褪黑素可以顯著提高皮質(zhì)顆粒正常分布率。皮質(zhì)顆粒在卵母細(xì)胞的高爾基體中產(chǎn)生,同時,高爾基體作為蛋白質(zhì)合成及運(yùn)輸?shù)募?xì)胞器,在卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮著重要作用。Cui 等研究表明,在卵母細(xì)胞成熟過程中添加高爾基體特異性抑制劑會導(dǎo)致減數(shù)分裂進(jìn)程的損害,同時卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟指標(biāo)如線粒體分布及皮質(zhì)顆粒分布出現(xiàn)異常。本研究通過檢測卵母細(xì)胞中高爾基體分布情況,發(fā)現(xiàn)在豬卵母細(xì)胞成熟過程中添加褪黑素可以顯著提高高爾基體的正常分布率。由此表明,褪黑素可以明顯提高與多精受精相關(guān)的細(xì)胞器,即皮質(zhì)顆粒和高爾基體在成熟豬卵母細(xì)胞中的正常分布情況。

    4 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中添加1nmol/L 的褪黑素雖然沒有提高豬卵母細(xì)胞的核成熟率,但可明顯提高豬卵母細(xì)胞體外受精后囊胚形成率,同時提高了豬卵母細(xì)胞成熟時期的皮質(zhì)顆粒、高爾基體的正常分布率,進(jìn)而抑制了豬卵母細(xì)胞的多精受精發(fā)生

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