β-胡蘿卜素對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎的緩解作用

宋 陽，朱凌羽，黃云鶴，呂軍田，鄭鑫*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；2.永吉縣畜牧獸醫(yī)工作總站，吉林吉林 132200；3.長春市九臺區(qū)畜牧總站，吉林長春 130519）

炎癥性腸病是一種慢性、復(fù)發(fā)性的腸道炎癥疾病，主要分為克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎2 種類型，臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的腹瀉、疼痛、血便和體重減輕。通過飲用水來向嚙齒動物施用葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium，DSS），建立潰瘍性結(jié)腸炎模型是使用最廣泛、快捷的方法，具有可重復(fù)性和可控性，DSS 會導(dǎo)致腸道通透性改變，炎性細(xì)胞引入。近年來，我國炎癥性腸病的發(fā)病率逐年增加，已成為世界范圍內(nèi)的衛(wèi)生保健問題，但炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明。目前用于治療炎癥性腸病的藥物對胃腸道和肝臟具有一些不良的副作用和并發(fā)癥，所以尋找一種低毒性、具有抗炎作用的天然藥物是解決問題的有效途徑。

-胡蘿卜素是類胡蘿卜素之一，在自然界中普遍存在。許多試驗研究表明，-胡蘿卜素具有抗氧化、清除自由基、增強(qiáng)免疫力、預(yù)防癌癥等功能，因此被廣泛用于食品、飲料、化妝品等行業(yè)。在現(xiàn)代畜牧行業(yè)，免疫營養(yǎng)已經(jīng)成為一種新概念，人們更加注重尋找安全、有效的天然藥物替代抗生素來保證動物的健康成長及生活質(zhì)量。本試驗用DSS 建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，探究-胡蘿卜素對潰瘍性結(jié)腸炎的緩解作用，為潰瘍性結(jié)腸炎的防治及-胡蘿卜素作為功能性飼料添加劑的推廣提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 DSS（MW:3600～5000，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），-胡蘿卜素（純度≥97%，美國Sigma 公司），RNA Lyzol、cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公司），BCA 法蛋白定量試劑盒、RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），ELISA 試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司），引物（上海生工生物工程股份有限公司），NF-B p65 抗體、p-NF-B p65 抗體、-actin 抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔抗體及山羊抗鼠（美國Cell Signaling Technology），便隱血試劑盒（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）。

1.1.2 儀器 Thermo 酶標(biāo)儀（上海賽默飛世爾科技有限公司），高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma 公司），熒光定量PCR 儀、凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司），切片機(jī)（德國Leica 公司）。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 試驗動物及分組 選取40 只6～7 周齡、體重（26±2）g 的昆明雄性小鼠（遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司）。將昆明小鼠隨機(jī)分為對照組、-胡蘿卜素組、DSS 組及-胡蘿卜素+DSS 組，每組10 只。將所有小鼠飼養(yǎng)在12 h 明暗交替循環(huán)、溫度（25±1）℃的無菌動物實驗室內(nèi)，飼養(yǎng)期間飼喂標(biāo)準(zhǔn)小鼠日糧，保證小鼠自由飲水與采食，適應(yīng)3 d 后進(jìn)行后續(xù)試驗，在試驗前禁食12 h。

1.2.2 試驗?zāi)Ｐ偷慕?將DSS 溶于蒸餾水中，制成濃度為3%（w/v）的DSS 溶液，-胡蘿卜素溶于橄欖油中。對照組及-胡蘿卜素組的小鼠自由飲水，而DSS 組和-胡蘿卜素+DSS 組小鼠自由飲用3%DSS 溶液；對-胡蘿卜素組與-胡蘿卜素+DSS 組小鼠灌胃100 mg/kg-胡蘿卜素，同時對照組與DSS 組進(jìn)行同等條件灌胃0.1 mL/10 g 的橄欖油。試驗期為7 d，期間每天對小鼠進(jìn)行稱重，在7 d 后處死小鼠，取結(jié)腸、血液。用生理鹽水清理取出的結(jié)腸，結(jié)腸前段用于qPCR 技術(shù)的測定，后段用于Western blot 的檢測，吸凈水分后放入液氮中凍存，中間部分結(jié)腸腸段在4% 多聚甲醛溶液中固定待用。

1.3 表觀指標(biāo)的觀測 監(jiān)測小鼠每天的體重變化，觀察精神和皮毛狀態(tài)，通過便隱血試劑盒檢測便血情況。根據(jù)表1 的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行疾病活動指數(shù)（Disease Activity Index，DAI）評分，試驗前記錄小鼠的結(jié)腸長度。

表1 DAI 評分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 結(jié)腸組織病理觀察 將各組固定在4%多聚甲醛溶液中的小鼠結(jié)腸組織經(jīng)過不同濃度梯度的乙醇脫水、二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋、切片；將切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟復(fù)水、蘇木精-伊紅染色、不同濃度的乙醇沖洗、二甲苯透明后，用中性樹膠封片進(jìn)行光鏡觀察。

1.5 ELISA 法檢測炎癥指標(biāo) 小鼠采用眼球采血，血液收集到1.5 mL 的離心管中，4℃靜置30 min 后放入冷凍離心機(jī)中，3 500 r/min 離心15 min，分離血清。參照ELISA 試劑盒說明書檢測血清中腫瘤壞死因子-（Tumour Necrosis Factor-，TNF-）、白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）、細(xì)胞因子白介素1（Interleu kin-1，IL-1）含量。

1.6 熒光定量PCR 檢測相關(guān)炎癥指標(biāo)的mRNA 表達(dá)取出凍存的結(jié)腸組織，根據(jù)RNA Lyzol 說明書提取組織中的RNA，并對樣品進(jìn)行RNA 質(zhì)量的檢測，使D/D及D/D保持1.8～2.0，隨后按照cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后采用熒光定量PCR 技術(shù)進(jìn)行表達(dá)量的測定。20 μL 反應(yīng)體系：SYBR 10 μL，上、下引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA 模板2 μL，ddHO 6 μL，采用95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s、60℃退火30 s、39個循環(huán)；65℃ 5 s、95℃ 5 s 的擴(kuò)增程序。每次試驗將18S RNA 設(shè)置為內(nèi)參，用2法計算結(jié)腸組織中的mRNA 相對表達(dá)量，引物序列如表2 所示。

表2 引物序列

1.7 Westorn Blot法檢測小鼠結(jié)腸中NF-B p65 及p-NF-B p65 的蛋白表達(dá) 取出凍存的結(jié)腸組織，并在冰上進(jìn)行以下操作：用預(yù)冷的PBS 洗滌1～2 次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液進(jìn)行組織勻漿后放入4℃高速離心機(jī)中，12 000 r/min 離心5 min，提取上清，采用BCA 法進(jìn)行蛋白濃度的測定。取60 μg 總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，用5% 的脫脂奶粉封閉1 h，選取兔源的NF-B p65 抗體（1:1 000）、兔源的p-NF-B p65 抗體（1:1000）及鼠源的-actin 抗體（1:5 000）作為一抗，4℃過夜孵育。用TBST 溶液洗膜后加入二抗：HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠（1:2 000），山羊抗兔（1:2 000），37℃孵育1 h，TBST 洗膜，進(jìn)行凝膠成像，蛋白表達(dá)量通過灰度分析的比值來表示。

1.8 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用單因素方差分析，使用SPSS 23.0 軟件對各處理組采用Duncan's 法進(jìn)行多重比較分析，<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1-胡蘿卜素對DAI 評分、小鼠日增重變化及結(jié)腸長度的影響 如圖1 所示，與對照組相比，DSS 組小鼠在試驗的第3 天體重下降（<0.05），DAI 分?jǐn)?shù)在第4 天呈相反趨勢（<0.05），結(jié)腸長度縮短（<0.05），-胡蘿卜素組小鼠的體重變化、DAI 以及結(jié)腸長度無顯著差異（>0.05）；而相較于DSS 組，-胡蘿卜素+DSS組小鼠的體重、DAI 分?jǐn)?shù)下降、結(jié)腸變長（<0.05）。綜合所述，小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型建立成功，-胡蘿卜素對小鼠無毒害作用并且對潰瘍性結(jié)腸炎具有緩解作用。

圖1 β-胡蘿卜素對DAI 評分、小鼠日增重變化及結(jié)腸長度的影響

2.2-胡蘿卜素對小鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)影響 如圖2所示，DSS 組中結(jié)腸的隱窩結(jié)構(gòu)異常，出現(xiàn)隱窩分支、扭曲、萎縮，杯狀細(xì)胞減少，伴有炎性浸潤；而-胡蘿卜素+DSS 組的結(jié)腸隱窩結(jié)構(gòu)異常變化較小，炎性浸潤較少；對照組及-胡蘿卜素組結(jié)腸的隱窩結(jié)構(gòu)正常。試驗結(jié)果表明，DSS 成功誘導(dǎo)了小鼠潰瘍性結(jié)腸炎，并且-胡蘿卜素能緩解潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸損傷。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織HE 染色

2.3-胡蘿卜素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血清中相關(guān)炎癥指標(biāo)的影響 如表3 所示，與對照組相比，DSS 組中TNF-、IL-6、IL-1含量升高（<0.05）；與DSS 組相比，-胡蘿卜素+DSS 組中TNF-、IL-1、IL-6 含量降低，其中IL-6 含量存在顯著差異。結(jié)果表明，-胡蘿卜素能降低炎性因子含量，減輕小鼠的結(jié)腸炎癥。

表3 β-胡蘿卜素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血清中炎性因子含量的影響

2.4-胡蘿卜素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸中炎性因子mRNA 相對表達(dá)量的影響 如圖3 所示，與對照組相比，DSS組小鼠結(jié)腸中mRNA 相對表達(dá)量升高（<0.05）；與DSS 組相比，-胡蘿卜素+DSS 組小鼠結(jié)腸的mRNA 相對表達(dá)量降低（<0.05）。結(jié)果表明，DSS可以誘導(dǎo)炎癥因子的基因表達(dá)，從而引發(fā)結(jié)腸炎癥，而-胡蘿卜素可以抑制的基因轉(zhuǎn)錄水平，緩解潰瘍性結(jié)腸炎。

圖3 β-胡蘿卜素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠炎性因子mRNA 相對表達(dá)量的影響

2.5-胡蘿卜素對小鼠結(jié)腸中NF-B 蛋白表達(dá)的影響如圖4 所示，DSS 組中小鼠結(jié)腸NF-B p65 的蛋白相對表達(dá)量高于對照組和-胡蘿卜素+DSS 組（<0.05），DSS 組中p-NF-B p65 的蛋白相對表達(dá)量高于對照組（<0.05）。結(jié)果表明，-胡蘿卜素可以通過抑制NFB p65 蛋白的活化來緩解DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎。

圖4 β-胡蘿卜素對小鼠結(jié)腸中NF-κB 蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

潰瘍性結(jié)腸炎在不同程度上可引起從直腸到近端結(jié)腸的連續(xù)黏膜炎癥，具有反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，其經(jīng)典組織學(xué)變化包括隱窩密度降低，隱窩結(jié)構(gòu)變形，不規(guī)則的黏膜表面和嚴(yán)重的彌漫性黏膜炎癥。本試驗結(jié)果表明，-胡蘿卜素的干預(yù)可以抑制結(jié)腸長度縮短，改善結(jié)腸組織中的隱窩異常結(jié)構(gòu)和炎性浸潤水平，能夠有效緩解造模小鼠的體重降低及便血腹瀉等現(xiàn)象。

炎癥是宿主對感染和組織損傷的一種保護(hù)性反應(yīng)，可作為預(yù)防病原體擴(kuò)散，促進(jìn)病原體破壞和傷口愈合的機(jī)制。盡管炎癥通常能及時得到解決，并且對宿主有益，但炎癥失調(diào)是多種慢性炎癥疾病的發(fā)病機(jī)制。潰瘍性結(jié)腸炎模型導(dǎo)致的組織學(xué)嚴(yán)重?fù)p害與高水平促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生密切相關(guān)。TNF-是TNF 超家族的原型成員，主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌，是炎癥反應(yīng)和相關(guān)疾病的產(chǎn)生和發(fā)展中的主要促炎細(xì)胞因子，在產(chǎn)生炎癥反應(yīng)中具有多種作用，如刺激促炎因子（IL-1、IL-6、IL-8、NF-B）和黏附因子的產(chǎn)生。IL-6 是一種具有184個氨基酸的四螺旋多效細(xì)胞因子，該蛋白質(zhì)由成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞合成，其合成和分泌在炎癥條件下誘導(dǎo)，在免疫反應(yīng)、炎癥和造血中起著重要作用。IL-1是抗微生物免疫以及自身免疫炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)、有效的促炎因子，對于宿主反應(yīng)和對病原體的抵抗至關(guān)重要，還會加劇慢性疾病和急性組織損傷期間的損害。這些細(xì)胞因子在腸道的免疫系統(tǒng)中起著重要作用，它們是免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵信號因子。本試驗結(jié)果表明，與對照組相比，DSS 組小鼠血清及組織中TNF-、IL-1、IL-6 的表達(dá)水平顯著升高；與DSS 組相比，-胡蘿卜素的添加能顯著抑制IL-6 的表達(dá)水平及結(jié)腸組織中TNF-的表達(dá)，說明-胡蘿卜素能有效抑制潰瘍性結(jié)腸炎小鼠TNF-、IL-1、IL-6 的表達(dá)水平。

長期以來，由于NF-B 在促炎因子基因（包括細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子）表達(dá)中的作用，核因子NF-B 途徑一直被認(rèn)為是典型的促炎信號傳導(dǎo)途徑，激活的NF-B p65 過度增加是許多慢性疾?。ㄈ珙愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、多發(fā)性硬化癥，甚至神經(jīng)退行性病變）的發(fā)病機(jī)理不可或缺的，因此，NF-B p65 信號通路已成為藥物開發(fā)和研發(fā)的關(guān)鍵點(diǎn)。本試驗結(jié)果表 明，DSS 組小鼠的NF-B p65 及p-NF-B p65的蛋白表達(dá)較對照組顯著升高，而-胡蘿卜素的干預(yù)抑制了NF-B p65 活化，與結(jié)腸組織中NF-B mRNA 表達(dá)相同，說明-胡蘿卜素能抑制炎癥因子的表達(dá)。

綜上所述，-胡蘿卜素能有效緩解DSS 誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎，可能是通過抑制NF-B 的表達(dá)及活化，進(jìn)而抑制促炎因子TNF-、IL-1、IL-6 的釋放。由此推斷，-胡蘿卜素緩解小鼠的潰瘍性結(jié)腸炎可能與NF-B 這條重要的信號通路有關(guān)，-胡蘿卜素作為一種天然的功能性飼料添加劑可能為預(yù)防和治療潰瘍性結(jié)腸炎開辟了一條新途徑。