超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定荔枝花粉花蜜中吡唑醚菌酯及其代謝物

王思威 劉艷萍 孫海濱

摘 要 采用改進的QuEChERS方法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了荔枝花粉和花蜜中吡唑醚菌酯及其主要代謝物BF 500-3的分析方法。樣品經(jīng)乙腈提取，分別由乙二胺-N-丙基硅烷 （PSA） 和十八烷基鍵合硅膠吸附劑 （C18） 凈化、濃縮后進樣分析，正離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測模式下，對基質(zhì)匹配標準溶液定量分析，考察了前處理和質(zhì)譜分析條件。結(jié)果表明，吡唑醚菌酯及其代謝物在1～100 μg/L濃度內(nèi)，基質(zhì)匹配標準溶液線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.991～0.999?；ǚ酆突刍|(zhì)中的平均回收率為87.0%～97.8%，相對標準偏差（RSD）為1.3%～3.7%，檢出限（LOD）為0.08～0.20 μg/kg，定量限 （LOQ）為0.20～0.50 μg/kg。 本方法簡便、快速、靈敏度高，適于荔枝花粉和花蜜樣品中吡唑醚菌酯及其代謝物的快速測定。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；吡唑醚菌酯；代謝物；花粉；花蜜

1 引 言

吡唑醚菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，于2001年在德國上市使用。甲氧基丙烯酸酯（Strobilurins）類殺菌劑具有對非靶標物低毒、對環(huán)境友好等特點。吡唑醚菌酯的主要代謝產(chǎn)物是BF 500-3（Methyl-N-[[[1-（4-chlorophenyl）-pyrazol-3-yl]oxy]-o-tolyl]-carbamate，結(jié)構(gòu)式見圖1），被認為與其母體具有相似的毒性[1]。目前，美國和加拿大已將吡唑醚菌酯的殘留量定義為吡唑醚菌酯母體及其代謝物BF 500-3之和[2，3]，規(guī)定吡唑醚菌酯在不同作物上的殘留限量[2，3]分別為0.04～40 mg/kg和0.2～200 mg/kg，均暫無荔枝及相關(guān)蜂產(chǎn)品上殘留限量規(guī)定； 國家標準GB 2763-2016規(guī)定了吡唑醚菌酯母體在荔枝上的最大殘留限量值為0.1 mg/kg[4]，暫無吡唑醚菌酯在各種植物花粉及花蜜中殘留限量的相關(guān)規(guī)定。因此，建立荔枝花粉和花蜜等不同基質(zhì)中母體及代謝物的分析方法十分必要，可為該藥母體及代謝物的殘留水平判定、殘留限量制訂等提供基礎(chǔ)。

目前，有關(guān)吡唑醚菌酯母體的分析方法報道較多[5～14]，代謝物BF 500-3分析的相關(guān)文獻很少，僅有在玉米和魚體中的殘留分析研究報道[15～17]，主要使用高效液相色譜法（HPLC-UV）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）等，蜂蜜及花粉基質(zhì)中農(nóng)藥的前處理方法主要采用固相萃取小柱（SPE）、基質(zhì)分散固相萃取（MSPD）、QuEChERS等凈化方法[18～20]。本研究在較為成熟的QuEChERS方法基礎(chǔ)上進行優(yōu)化，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了荔枝花粉和花蜜中吡唑醚菌酯母體及主要代謝產(chǎn)物BF 500-3的測定分析方法，樣品用量少、簡便、快速，提高了前處理及檢測效率。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent LC-1200高效液相色譜-串聯(lián)AB Sciex 4000Q Trap 質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源（ESI）； Milii-Q超純水機（美國Millipore公司）； LD5-2A離心機（雷勃爾醫(yī)藥公司）； OA-SYS氮吹儀（美國）； XW-80A渦旋儀（上海精科有限公司）。

乙腈（色譜純，美國Fisher公司）； 甲酸（色譜純，美國Fluka公司）； 無水MgSO4、NaCl、二水合檸檬酸鈉、檸檬酸二鈉鹽（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）； 十八烷基鍵合硅膠吸附劑 （C18）、乙二胺N-丙基硅烷吸附劑 （PSA）（上海安譜實驗科技股份有限公司）； 吡唑醚菌酯標準品（99.5%，美國Chem Service公司）； BF 500-3標準品（99.9%，德國巴斯夫公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品處理 實驗中所用花粉和花蜜樣品均來自荔枝龍眼產(chǎn)業(yè)體系示范園中的荔枝花粉和蜜蜂采集的荔枝蜜。其中花粉樣品是將花朵樣品采回，待花藥自然晾干裂開后，獲得花粉樣品。（1）花粉準確稱取荔枝花粉樣品2.0 g，置入50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，再加入8 mL超純水和3 mL正己烷進行提取，繼續(xù)加入4 g無水MgSO4、1 g NaCl、1 g二水合檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸二鈉鹽，立即劇烈振蕩，渦旋1 min，5000 r/min離心2 min。取6 mL乙腈溶液至加有0.9 g無水MgSO4、0.15 g PSA， 0.15 g C18的離心管中，立即手動劇烈振蕩，渦旋10 s，5000 r/min離心2 min。取上清液4 mL至10 mL錐形管中，氮吹至約50 μL，用含0.1%甲酸的乙腈定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，待測。（2）花蜜 準確稱取荔枝花蜜樣品5.0 g，置入50 mL離心管中，加入10 mL超純水，使其充分溶解花蜜樣品達到均勻狀態(tài)，然后加入10 mL乙腈進行提取，繼續(xù)加入4 g無水MgSO4、1 g NaCl、1 g二水合檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸二鈉鹽，劇烈振蕩，渦旋1 min， 5000 r/min離心2 min。取6 mL乙腈至加有0.9 g無水MgSO4、0.15 g PSA的離心管中，手動劇烈振蕩，渦旋10 s，5000 r/min離心2 min。移取上清液4 mL至10 mL錐形管中，氮吹近干，用含0.1%甲酸的乙腈定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，待測。

2.2.2 色譜-質(zhì)譜條件 （1）色譜 色譜柱為Poroshell-120 EC-C18 （150 mm×3.0 mm， 2.7 μm）； 流動相A為0.1%（V/V）甲酸溶液，B為乙腈，A∶B=25∶75（V/V），運行7 min； 流速 0.4 mL/min； 柱溫35℃； 進樣量5 μL。（2）質(zhì)譜 ESI+，多反應(yīng)監(jiān)測模式，離子源溫度550℃，氣簾氣壓30 psi，毛細管電壓5500 V，霧化氣壓力50 psi。其它相關(guān)參數(shù)見表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 前處理條件優(yōu)化

3.1.1 提取方式選擇 對比了固相萃取技術(shù)（SPE）、基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)（MSPD）和QuEChERS方法（圖2）。結(jié)果表明，采用氨基SPE和石墨化碳黑SPE，吡唑醚菌酯和BF 500-3的回收率低于50%，采用C18，洗脫速率極慢，回收率較低。MSPD方法相比于SPE，提取和凈化可同時完成，但對于脂肪含量較高的花粉樣品需要經(jīng)過2次以上的凈化過程，才能較好地去除雜質(zhì)，費時費力； QuEChERS方法具有快速、簡單、有效的特點，通過加入不同量的PSA和C18吸附劑，能夠較好地去除脂類、糖類等共萃取物質(zhì)，回收率滿足分析要求，適于本研究中目標農(nóng)藥的分析測定。

3.1.2 提取溶劑的選擇 對比了丙酮、乙酸乙酯和乙腈作為提取劑時吡唑醚菌酯和BF 500-3的提取效果。結(jié)果表明，丙酮極易與水互溶，提取過程中共提取物質(zhì)較多，尤其是色素和脂肪，凈化效果較差，增加了后續(xù)吸附劑的選擇難度及凈化過程的復(fù)雜程度； 乙酸乙酯微溶于水的特性導(dǎo)致其不能將強極性的目標農(nóng)藥從基質(zhì)中完全提取，回收率低； 乙腈與水互溶，且通過NaCl鹽析作用，可使水-乙腈兩相界面分層明顯，且基質(zhì)相對干凈。因此，本研究選擇乙腈作為提取溶劑。

3.1.3 提取溶劑用量確定 以添加水平100 μg/kg的花蜜為研究對象，分別考察了5、10和15 mL乙腈對吡唑醚菌酯和BF 500-3的提取效率。結(jié)果表明，采用10 mL乙腈能達到充分提取目標分析物的目的。本研究使用的花粉中有較高含量的脂肪酸和脂肪酸酯類化合物，它們是蜂蠟的主要成分，通過在提取步驟中加入非極性的正己烷，可以有效去除該類化合物干擾。對加入正己烷的用量進行了考察。當正己烷的用量<3 mL時，不能將非極性干擾雜質(zhì)完全去除； 當正己烷的用量≥3 mL時，目標物的回收率穩(wěn)定不變，且有小圓餅狀的油脂物析出，雜質(zhì)去除效果良好?；诠?jié)約溶劑和環(huán)保的考慮，選擇正己烷用量為3 mL。

3.1.4 吸附劑的選擇 針對不同基質(zhì)特點，選擇有效吸附劑。無水MgSO4作為干燥劑，主要用于除去水分，避免分析物保留在水中而不易被有機溶劑充分提?。?PSA為弱陰離子交換填料，能夠有效去除基質(zhì)中糖類、脂肪酸等物質(zhì)； C18吸附劑為硅膠基質(zhì)鍵合十八烷基填料，具有比表面積大、吸附能力強的特點，可較好除去脂類、脂肪等非極性物質(zhì)的干擾。由于花蜜中的干擾雜質(zhì)相對花粉較少，主要含有約70%葡萄糖和果糖，采用PSA可有效去除糖類物質(zhì)； 花粉中含有大量脂類、黃酮類和糖類等成分，采用PSA+C18聯(lián)合應(yīng)用能夠有效去除油脂等干擾。

3.1.5 吸附劑用量的確定

以添加水平為100 μg/kg的花粉為研究對象，分別考察了0.05、0.10、0.15和0.2 g的PSA和C18對吡唑醚菌酯和BF 500-3的凈化效果。結(jié)果表明， 0.15 g PSA和0.15 g C18聯(lián)用使用，可明顯改善花粉的凈化效果，回收率均在80%以上，滿足分析要求。

3.2 儀器條件優(yōu)化

3.2.1 流動相的選擇 吡唑醚菌酯在甲醇中溶解度為100.8 g/L，在乙腈中溶解度>500 g/L，因此選擇乙腈-水相體系作為流動相。水相中添加甲酸使目標物形成[M+H]+離子模式，并以[M+H]+作為母離子能夠獲取較強的離子碎片，且響應(yīng)較高，目標物的峰形更對稱，提高了檢測的靈敏度。由于吡唑醚菌酯和BF 500-3在酸堿條件下（pH 為5、7、9）均很穩(wěn)定[20]，因此不需要加入乙酸銨形成緩沖體系。

3.2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 將吡唑醚菌酯及其代謝物BF 500-3標準溶液0.1 mg/L采用單針自動進樣分析，可產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+H]+離子，確定目標農(nóng)藥的準分子離子峰，并優(yōu)化去簇電壓。準分子離子峰進入二級質(zhì)譜，發(fā)生斷裂或重排等碎裂反應(yīng)，產(chǎn)生不同的離子碎片，在選擇離子監(jiān)測模式下，優(yōu)化其碰撞能量（二級離子質(zhì)譜圖見圖3）。

3.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為對目標化合物的信號增強或抑制作用?？疾炝诉吝蛎丫ゼ捌浯x物BF 500-3在試劑和花粉、花蜜基質(zhì)中的響應(yīng)情況（添加水平100 μg/kg）。結(jié)果表明，采用標準溶液進行實驗的回收率均低于花粉和花蜜兩種基質(zhì)標準溶液，說明基質(zhì)對分析物表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，原因可能是花蜜和花粉2種基質(zhì)中含水量低，導(dǎo)致基質(zhì)共萃物濃縮。本實驗采用基質(zhì)匹配溶液校正基質(zhì)效應(yīng)的方法，確保實驗結(jié)果的準確性。

3.4 方法的線性范圍及檢出限

由表2可知，在1～100 μg/L范圍內(nèi)，吡唑醚菌酯和BF 500-3的花粉和花蜜基質(zhì)匹配標準溶液的峰面積與對應(yīng)的質(zhì)量濃度間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均>0.990。以3倍信噪比（S/N=3）計算的花蜜和花粉中的檢出限 （LOD），以10倍信噪比（S/N=10）確定定量限 （LOQ）。魚體中吡唑醚菌酯和BF 500-3的LOD和LOQ分別為5 和10 μg/L[15]； 玉米中吡唑醚菌酯的LOD和LOQ分別為0.45～5 μg/kg和2～20 μg/kg，BF 500-3的LOD和LOQ分別為1～4 μg/kg和2～10 μg/kg[16]。本方法的LOD和LOQ均低于文獻中的報道。

3.5 實際樣品分析

對某地區(qū)5個示范園荔枝花粉和花蜜樣品進行檢測，均未檢出吡唑醚菌酯及其代謝物。在10～100 μg/kg添加水平下，吡唑醚菌酯和BF 500-3在荔枝花粉和花蜜中的平均添加回收率分別為87.0%～96.4%和90.5%～97.8%， 相對標準偏差（RSD）分別為1.3%～3.5%和2.3%～3.7%（見表3、圖4）。方法回收率為60%～120%，RSD<20%，符合殘留分析檢測要求[21]。

上述實驗結(jié)果表明，本方法所用樣品量少、方便、快捷，且凈化效果好， 采用基質(zhì)匹配標準溶液消除基質(zhì)效應(yīng)，適用于快速檢測荔枝花粉和花蜜中吡唑醚菌酯和主要代謝產(chǎn)物BF 500-3。

References

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2 https：//www.ecfr.gov/cgi-bin/text-idx？SID=f9d542711a66ba5c0a2206dce8428c32&mc;=true&node;=se40.26.180_1582&rgn;=div8

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