鉛離子誘導(dǎo)PS2.M構(gòu)象改變特性及其氡非標(biāo)記比色傳感檢測(cè)新方法

劉紅文 季穎 宋春麗 田剛 李詩雅 楊桂英 呂昌銀

摘 要 以氡輻射衰變最終形成穩(wěn)定的子體鉛作為目標(biāo)檢測(cè)物，建立了檢測(cè)氡累積濃度的核酸適配體生物分析新方法。K+誘導(dǎo)富G單鏈核苷酸PS2.M形成反平行G-四鏈體四鏈體，輔因子血紅素與G-四聯(lián)鏈體結(jié)合，形成具有過氧化物酶活性的穩(wěn)定復(fù)合物，催化TMB-H2O2體系發(fā)生顯色反應(yīng)。同時(shí)加入Pb2+時(shí)，Pb2+誘導(dǎo)PS2.M形成結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定的“缺口”型反平行G-四鏈體，K+和血紅素游離在溶液之中，體系吸光度響應(yīng)值急劇降低。基于此構(gòu)建了一種基于Pb2+誘導(dǎo)PS2.M構(gòu)象改變的過氧化物酶活性“Turn-off”型比色傳感器。在5.0×109～1.8×107 mol/L范圍內(nèi)，吸光度降低值ΔA與Pb2+濃度呈線性關(guān)系，線性回歸方程為ΔA=0.36+0.13C， R=0.9987。本方法對(duì)Pb2+的檢出限為3.76 nmol/L （S/N=3），氡的檢出限為1.96×103 Bq·h/m3 （S/N=3）。本方法靈敏、準(zhǔn)確，樣品溶液可直接檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，避免了現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行氡輻射劑量測(cè)量的放射性危害，為環(huán)境中氡的檢測(cè)提供了新方法。

關(guān)鍵詞 氡；子體鉛；核酸適配體；G-四鏈體；構(gòu)象轉(zhuǎn)變；比色傳感

1 引 言

氡是天然放射系中唯一無色、無嗅、無味的氣體放射性元素，半衰期為3.82天，是室內(nèi)放射性氣體污染物的主要存在形式[1，2]。經(jīng)過一系列短壽命子體鏈的衰變，氡產(chǎn)生的穩(wěn)定子體210Pb半衰期長(zhǎng)達(dá)21年[3]。室內(nèi)氡照射和吸煙具有協(xié)同效應(yīng)，是導(dǎo)致肺癌的第二大殺手[4，5]。世界衛(wèi)生組織與國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將氡列為19種致癌物質(zhì)之一[6]。研究表明，21世紀(jì)以來我國(guó)室內(nèi)平均氡濃度較20世紀(jì)80年代和90年代分別上升了57%和42%[7]，室內(nèi)氡污染的危害受到越來越多的關(guān)注。因此，科學(xué)有效地采集和檢測(cè)室內(nèi)中的氡濃度，建立經(jīng)濟(jì)、有效、簡(jiǎn)便/快捷的檢測(cè)氡的累積輻射劑量的方法具有重要的衛(wèi)生學(xué)意義[8]。

近年來，核酸適配體（Aptamer）已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、臨床診斷、藥物篩選和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域[9～11]。在重金屬離子的檢測(cè)中，核酸適配體得到了充分應(yīng)用，Liu[12]和Jiang[13] 等利用Hg2+可以形成T-Hg-T結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的高特異性和高靈敏度的檢測(cè)。Lu等[14]通過Pb2+能誘導(dǎo)富G核酸鏈-TBAA特異性形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)Pb2+的高特異性和高靈敏度的可視化檢測(cè)。鄧歡等[15]將門控制效應(yīng)和核酸適配體結(jié)合，構(gòu)建檢測(cè)Pb2+的電化學(xué)生物傳感器。Long[16]與Deng[17] 等基于Pb2+誘導(dǎo)核酸適配體PW17和T30695構(gòu)型改變導(dǎo)致體系熒光強(qiáng)度變化，開展了氡的非標(biāo)記熒光傳感生物分析新方法研究。

G-四鏈體構(gòu)象的穩(wěn)定性與其所結(jié)合的陽離子種類有關(guān)，不同構(gòu)型G-四鏈體與Hemin結(jié)合后催化活性差異明顯，表現(xiàn)出不同的過氧化物酶活性[18～20]。Kong研究組基于G-四鏈體與Hemin結(jié)合具有過氧化物酶活性，催化ABTS-H2O2系統(tǒng)顯色，構(gòu)建了Ag+、Hg2+等重金屬的檢測(cè)平臺(tái)[21～23]。本研究根據(jù)氡輻射衰變特點(diǎn)，結(jié)合Pb2+的現(xiàn)代分析技術(shù)，研究了K+和Pb2+誘導(dǎo)PS2.M分別形成不同結(jié)構(gòu)G-四鏈體的特性，建立了一種基于Pb2+誘導(dǎo)PS2.M構(gòu)象改變的過氧化物酶活性“Turn-off”型比色傳感器，實(shí)現(xiàn)了Pb2+和氡的靈敏檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器和試劑

UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津儀器公司）； J-815圓二色譜光譜儀（日本Jasco公司）； AB204-S電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）； PB-20（PB-S）型精度酸度計(jì)（德國(guó)賽多利斯公司）； 氡室（南華大學(xué)核工業(yè)第六研究所）； 混合纖維素膜（Merck Milipore公司）。

冰醋酸（HAc，天津市福晨化學(xué)試劑廠）； 三羥甲基氨基甲烷（Tris）、KCl（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液（100.0 μg/mL，中國(guó)計(jì)量科學(xué)院）； 富含鳥嘌呤的寡核苷酸鏈PS2.M（5'-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3'，上海生工生物工程股份有限公司合成）； 氯化血紅素（Hemin）、3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB， 上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）； HCl、H2O2（廣東光華科技股份有公司）； 實(shí)驗(yàn)用水均為滅菌超純水（電阻率為18.25 MΩ·cm）。

2.2 氡樣本的采樣方法[16]

以10 mL 0.2%（V/V）冰醋酸作為吸收液，以直徑70 mm、高17 mm一次性塑料培養(yǎng)皿為收集器，在平皿口加封混合纖維素膜（孔徑為0.8 μm，Milipore公司）； 設(shè)定采樣時(shí)間，將采樣器放入氡室，被動(dòng)式采集含鉛樣本。采樣后密封狀態(tài)、室溫放置4天，經(jīng)過氡的半衰期，用0.2%醋酸定容至10 mL，混勻，4℃保存，待測(cè)。

2.3 Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外可見光譜測(cè)定[19]

在反應(yīng)管中，依次加入一定濃度的Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液、50 μL 100 mmol/L Tris-HAC緩沖液（pH=5.0）、10 μL 10 μmol/L K+標(biāo)準(zhǔn)溶液、 20 μL 25 μmol/L Hemin試劑和50 μL 1 μmol/L PS2.M溶液，充分混勻后，在室溫下反應(yīng)20 min。然后加入30 μL 5 mmol/L TMB及20 μL 100 mmol/L H2O2，混勻，室溫下放置35 min后，加入50 μL終止液（2 mol/L HCl），用超純水定容至500 μL，混勻，用UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 比色傳感原理

根據(jù)氡最終衰變成為子體鉛，210Pb的半衰期達(dá)21年的特點(diǎn)，本研究以子體鉛作為目標(biāo)檢測(cè)物，研究建立氡濃度的核酸適配體生物分析新方法。氡是一種氣態(tài)放射物質(zhì)，密度9.73 g/m3，易溶于水，本研究選擇稀醋酸作為吸收液，并用微孔混和纖維素膜覆蓋采樣器進(jìn)氣口，排除了空氣干擾物，氡衰變后的子體鉛與稀醋酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成Pb2+。

如圖1所示，未加入Pb2+時(shí)，K+誘導(dǎo)PS2.M形成反式平行G-四鏈體，該四鏈體與輔因子血紅素（Hemin）結(jié)合，形成穩(wěn)定的具有過氧化物酶活性的復(fù)合物，催化TMB-H2O2系統(tǒng)氧化顯色。當(dāng)體系中同時(shí)引入Pb2+和K+時(shí)，這兩種離子競(jìng)爭(zhēng)與PS2.M的反應(yīng)，但由于Pb2+與之作用能力更強(qiáng)，誘導(dǎo)PS2.M發(fā)生構(gòu)象改變，形成結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定的G-四鏈體，抑制了K+的誘導(dǎo)能力，使輔因子血紅素游離在溶液之中，抑制了TMB-H2O2體系氧化還原反應(yīng)的進(jìn)行，體系吸光度急劇降低。椐此，建立基于Pb2+誘導(dǎo)的PS2.M構(gòu)象改變的比色法檢測(cè)Pb2+和氡[19]。

3.2 紫外-可見光吸收光譜和圓二色譜表征

由圖2可見，單獨(dú)TMB+H2O2體系不發(fā)生顯色反應(yīng) （曲線c）； 曲線a在451 nm處有最大吸收峰，說明K+誘導(dǎo) PS2.M形成的G-四鏈體結(jié)合血紅素的復(fù)合物具有類過氧化物酶活性，對(duì)TMB-H2O2氧化還原反應(yīng)具有明顯的催化作用； 曲線b在451 nm處吸光度明顯降低，其原因是Pb2+將K+從已經(jīng)形成的反式平行G-四鏈體中競(jìng)爭(zhēng)出去，使PS2.M構(gòu)象發(fā)生改變，輔因子血紅素游離在溶液之中，抑制了TMB-H2O2體系的氧化還原反應(yīng)，體系吸光度響應(yīng)值急劇降低。

圓二色譜測(cè)定結(jié)果如圖3所示，體系溶液中只有PS2.M時(shí)，在260 nm處出現(xiàn)一個(gè)正峰，加入K+后，在295 nm處出現(xiàn)一個(gè)正峰，符合K+誘導(dǎo)PS2.M形成反平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)的特征[24]。在PS2.M中加入Pb2+后，在265 nm處有一個(gè)負(fù)峰，312 nm處出現(xiàn)一個(gè)正峰，這是被Pb2+誘導(dǎo)形成反平行G-四鏈體的峰的典型譜特征[24～26]。當(dāng)向PS2.M溶液中同時(shí)加入K+和Pb2+時(shí)，295 nm處的正峰消失，只在312 nm處出現(xiàn)正峰，且“PS2.M+ K++Pb2+”體系和“PS2.M+Pb2+”體系的圓二色譜圖形非常接近，說明K+和Pb2+競(jìng)爭(zhēng)與PS2.M反應(yīng)，Pb2+的存在，抑制了K+誘導(dǎo)PS2.M構(gòu)象改變的能力，也說明了Pb2+與PS2.M結(jié)合形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、更容易形成[24]。

3.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

改變Tris-HAc緩沖液的pH值，考察pH值對(duì)反應(yīng)體系的影響。結(jié)果表明，pH值對(duì)體系吸光度變化值（ΔA）影響較大。pH=4.0～5.0時(shí)，隨pH值增大，ΔA值逐漸上升； pH=5.0～7.5時(shí)，隨pH值增大，ΔA值逐漸下降，因此選擇pH=5.0的Tris-HAc溶液維持體系的酸堿性。在pH=5.0條件下進(jìn)行Tris-HAc緩沖液用量的優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)Tris-HAc緩沖液終濃度為10 mmol/L時(shí)體系吸光度值變化最顯著。

TMB作為一種顯色劑，其用量對(duì)體系吸收值有一定影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用量為0.3 mmol/L時(shí)體系吸光度值變化顯著且反應(yīng)穩(wěn)定。Hemin作為輔助因子，用量為1 μmol/L時(shí)，體系吸光度值變化最顯著。

Pb2+與K+競(jìng)爭(zhēng)誘導(dǎo)PS2.M發(fā)生構(gòu)象改變需要一定的反應(yīng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)表明，加入PS2.M20 min后，ΔA值逐漸增大； 當(dāng)時(shí)間超過20 min后，ΔA值變化比較平緩，故選擇20 min作為PS2.M最佳孵育時(shí)間?？疾炝薚MB與H2O2顯色時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，最終選擇在反應(yīng)40 min后加入HCl終止反應(yīng)。

3.4 共存干擾物的影響

如圖4所示，10倍濃度的Bi3+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、NH+4以及Cr3+和 Hg2+對(duì)160 nmol/L Pb2+測(cè)定的干擾很小。由于本方法通過采集氡的子體鉛進(jìn)行氡的檢測(cè)，采樣時(shí)，在采樣器進(jìn)氣口加封0.8 μm的混和纖維素微孔膜，保證氣體氡可以輻射進(jìn)入采樣容器，以利于采集子體鉛，阻止了空氣中其它顆粒干擾物進(jìn)入采樣容器。因此，這些干擾物質(zhì)在樣品采集時(shí)大部分已被排除在容器外，其可能產(chǎn)生的影響被進(jìn)一步降低，不干擾測(cè)定。

3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

測(cè)定Pb2+系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值A(chǔ)及未加Pb2+的試劑空白溶液的吸光度值A(chǔ)0。計(jì)算各反應(yīng)的ΔA（=A0-A）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖5所示，體系的吸光度差值ΔA與Pb2+濃度在0.5×108～1.8×107 mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為ΔA=0.36+0.13CPb（108 mol/L），相關(guān)系數(shù)R=0.9987。對(duì)空白溶液平行測(cè)定11次，計(jì)算空白溶液的標(biāo)準(zhǔn)偏差為sb=0.165，按照CL=3sb/k計(jì)算出Pb2+的檢出限為3.76 nmol/L。

3.6 氡累積濃度的測(cè)定和模型建立

按照采樣方法，在南華大學(xué)核六所氡實(shí)驗(yàn)室采集累積濃度分別為0.71、1.45、3.54、6.57、10.17、13.78、17.60、21.70和25.25（104 Bq·h/m3）的氡輻射樣品溶液，采用本方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1。ΔA值隨著氡累積濃度的增加而增大，根據(jù)Pb2+的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程ΔA=0.36+0.13CPb（108 mol/L），可得知樣品中Pb2+含量也逐漸增加。由圖6可見，在一定范圍內(nèi)，氡濃度與ΔA值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系：ΔA=0.089CRn+0.59， R=0.9906。由此可建立氡的累積濃度與子體鉛之間的定量測(cè)定模型。本方法對(duì)氡的檢測(cè)范圍為7.10×103～1.02×105 Bq·h/m3， 檢出限為1.96×103 Bq·h/m3 （3σ）。

3.7 樣品分析與方法學(xué)比較

我國(guó)GB/T18883-2002《室內(nèi)空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，室內(nèi)空氣應(yīng)無毒、無害、無異常嗅味，其中放射性參數(shù)氡（222Rn）年平均值 400 Bq/m3（標(biāo)準(zhǔn)值），達(dá)到此水平建議采取干預(yù)行動(dòng)以降低室內(nèi)氡濃度。徑跡蝕刻法是中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，對(duì)氡累積濃度的檢出限為2.1×103 Bq·h/m3[27]，本方法對(duì)氡累積濃度的檢出限為1.96×103 Bq·h/m3（< 2.1×103 Bq·h/m3），檢出限更低。

按照采樣方法，采集了2個(gè)氡樣本，用本方法與美國(guó)RAD7測(cè)氡儀進(jìn)行對(duì)比測(cè)定。結(jié)果如表2，對(duì)兩種方法t檢驗(yàn)結(jié)果表明，在可信區(qū)間為95%的范圍內(nèi)，計(jì)算出t1=1.35，t2=0.59，均小于理論值t0.05（10）=2.228， 按照α=0.05的水平接受H0，即差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為兩種方法測(cè)定結(jié)果的總體均數(shù)相同，證明本方法測(cè)定的結(jié)果可靠。

4 結(jié) 論

以氡輻射衰變最終形成穩(wěn)定的子體鉛作為目標(biāo)檢測(cè)物，建立了檢測(cè)氡累積濃度的核酸適配體生物分析新方法。本方法儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)單快速、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高，Pb2+的檢出限為3.76 nmol/L，氡的檢出限為1.96×103 Bq·h/m3。在核科學(xué)和物理學(xué)中，一般針對(duì)氡輻射產(chǎn)生的α射線測(cè)定氡的累積濃度。本方法避免了現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行氡輻射劑量測(cè)量的放射性危害，具有良好的應(yīng)用潛能。

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