TGF-β2對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞SPARC表達(dá)的影響

郭 瑞

晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)是多種類型白內(nèi)障(如后發(fā)性白內(nèi)障)發(fā)生的細(xì)胞學(xué)機(jī)制[1-3]，具體的分子機(jī)制尚不明確。我們前期研究表明，TGF-β2能夠誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使人晶狀體上皮細(xì)胞喪失上皮細(xì)胞極性，獲得間質(zhì)特性，成功建立了人晶狀體上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型[4-5]。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)是一個(gè)與白內(nèi)障密切相關(guān)的基因，敲除SPARC基因的小鼠，白內(nèi)障發(fā)病率為100%[6]。SPARC基因位于人9號(hào)染色體、鼠11號(hào)染色體，對(duì)人和鼠的SPARC基因系列分析結(jié)果顯示具有高度的相似性。本研究擬在前期研究工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討TGF-β2對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞SPARC表達(dá)的影響，以期為白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制提供確切的理論依據(jù)，為晶狀體相關(guān)疾病的防治提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 試劑材料

HLECs-B3細(xì)胞株(美國(guó)ATCC公司)；人源TGF-β2(美國(guó)Pepro Tech公司)；胰蛋白酶、DMEM低糖細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)(日本同仁化學(xué)研究所)；BCA蛋白定量試劑盒(德國(guó)Merk 公司)；兔抗人SPARC抗體(15274-1-AP，美國(guó)Proteintech公司)；小鼠抗人GAPDH抗體 (#M20006)(上海Abmart公司)；HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗(BAl050)、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(BAl054)(武漢博士德公司)。

1.2 方法

1.2.1 HLECs-B3細(xì)胞株的培養(yǎng)及分組 培養(yǎng)HLECs-B3細(xì)胞，采用體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，于37℃ 、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，加入10 ng/ml的TGF-β2，在無(wú)血清培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)0 h、6 h、16 h、24 h，收集各組細(xì)胞，進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)和western blot分析。0h細(xì)胞為對(duì)照組，6 h、16 h和24 h細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2 共聚焦細(xì)胞免疫熒光：使用體積分?jǐn)?shù)4%的甲醛室溫固定細(xì)胞30 min；PBS洗3次，每次5 min；體積分?jǐn)?shù)0.2%Triton X-100透化3 min；PBS洗3次，每次5 min；質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%BSA室溫封閉30 min；加用3%BSA稀釋的一抗(1∶50)后放人濕盒里，4℃孵育過(guò)夜；取出濕盒至常溫復(fù)溫1 h，PBS洗3次，每次5 min；常溫、避光條件下用熒光二抗孵育1 h(1∶500)；PBS洗3次，每次5 min；常溫、避光條件下孵育DAPI 5 min；PBS洗3次，每次5 min；抗熒光淬滅封片劑封片；激光掃描共焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 Western blotting 使用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量，并調(diào)整蛋白濃度，通過(guò)SDS-PAGE凝膠進(jìn)行分離，然后電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫下封膜3小時(shí)，用含有0.1%吐溫20(TBST)的Tris緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。隨后在4℃以下將膜孵育一抗過(guò)夜：兔抗人多克隆抗體SPARC(1∶500)和小鼠抗人單克隆抗體GAPDH(1∶5000)。然后將膜孵育二抗1小時(shí)，使用山羊抗兔二抗或山羊抗小鼠二抗，二抗使用TBST稀釋5000倍。用TBST將膜洗滌三次，每次5分鐘。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑和膠片檢測(cè)所述免疫反應(yīng)的蛋白條帶。掃描膠片，使用GEL-PRO Analyzer軟件4.0進(jìn)行分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。TGF-β2不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞中SPARC的平均灰度值的比較采用單因素方差分析，各組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 共聚焦細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了研究TGF-β2對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞SPARC表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)首先采用共聚焦細(xì)胞免疫熒光法，觀察使用TGF-β2培養(yǎng)HLECs-B3細(xì)胞前后細(xì)胞內(nèi)SPARC的分布及表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)組取了6 h、16 h和24 h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)觀察，0 h為對(duì)照組。結(jié)果如圖1所示，在第一列圖中SPARC蛋白顯示為金色熒光，在第二列圖中細(xì)胞核顯示為藍(lán)色熒光，第三列合圖中SPARC蛋白顯示為紅色熒光、細(xì)胞核顯示為藍(lán)色熒光。根據(jù)SPARC熒光在細(xì)胞內(nèi)的分布和熒光強(qiáng)弱來(lái)判斷，SPARC蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達(dá)變化。共聚焦細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著TGF-β2培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，SPARC蛋白表達(dá)的熒光逐漸增多增強(qiáng)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞SPARC表達(dá)的熒光均較對(duì)照組增多增強(qiáng)。

圖A、D、G、J：各組細(xì)胞SPARC的表達(dá)顯示為金色熒光，圖B、E、H、K：各組細(xì)胞核顯示為藍(lán)色熒光，圖C、F、I、L：合成圖，SPARC蛋白顯示為紅色熒光、細(xì)胞核顯示為藍(lán)色熒光。隨著TGF-β2培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，SPARC蛋白表達(dá)的熒光明顯增多增強(qiáng)。

圖1細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)SPARC在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)(×400)

2.2 Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果

免疫熒光不能定量，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步用Western blotting法進(jìn)行客觀定量檢測(cè)。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著TGF-β2培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，SPARC表達(dá)量增加，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞SPARC表達(dá)量均較對(duì)照組明顯增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)組中，16 h組較6 h組SPARC表達(dá)量明顯增加，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；24 h組較6 h組SPARC表達(dá)量明顯增加，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；24 h組較16 h組細(xì)胞SPARC表達(dá)量無(wú)明顯增加，其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。

A：SPARC表達(dá)的電泳圖 B：各組SPARC表達(dá)的量化比較
*表示：與對(duì)照組(0h)比較P<0.05

圖2 Western blot法檢測(cè)SPARC的表達(dá)水平

3 討論

白內(nèi)障是人類首位致盲性眼病，后發(fā)性白內(nèi)障是白內(nèi)障術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，后囊膜混濁在術(shù)后1～5年的發(fā)生率成人為11%～50%，兒童由于晶狀體上皮細(xì)胞強(qiáng)大的增殖能力，后囊膜混濁發(fā)生率可達(dá)100%[7-8]。老年白內(nèi)障術(shù)后1天、1周、1個(gè)月及3個(gè)月低視力發(fā)生率依次為18.78%、12.96%、11.64%、10.58%[9]。白內(nèi)障的基礎(chǔ)研究具有很高的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科研價(jià)值，其不僅僅是為了解決該疾病的治療問(wèn)題，對(duì)于晶狀體發(fā)生發(fā)育，眼球的發(fā)生發(fā)育及其與各種眼部疾病之間的聯(lián)系的深入認(rèn)識(shí)均具有深刻的意義。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)是晶狀體在各種生理和病理狀態(tài)下重要的調(diào)節(jié)因子，與后發(fā)性白內(nèi)障的形成有密切關(guān)系[10]。哺乳動(dòng)物中存在TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三種TGF-β同源異構(gòu)體，其中TGF-β2在眼內(nèi)房水及玻璃體內(nèi)的含量及活性最高，是參與調(diào)節(jié)晶狀體上皮細(xì)胞最強(qiáng)的細(xì)胞因子之一。TGF-β2能夠誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使人晶狀體上皮細(xì)胞喪失上皮細(xì)胞極性，獲得較強(qiáng)的遷移、侵襲、抗凋亡能力等間質(zhì)特性，從而具有類肌纖維母細(xì)胞樣的特征，目前已成為白內(nèi)障(包括前囊膜下和后囊膜混濁)形成的細(xì)胞模型而被用于基礎(chǔ)科學(xué)研究。

富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白SPARC，又稱BM-40或骨粘連蛋白，是一種細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)成分，改變基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，具有抗粘附和抗血管生成的作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、粘附及移行[11-12]。本研究表明，在使用TGF-β2誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、構(gòu)建白內(nèi)障細(xì)胞模型的過(guò)程中，SPARC蛋白的表達(dá)量明顯增加。一項(xiàng)研究表明，與正常人的晶狀體前囊膜相比，白內(nèi)障患者的晶狀體前囊膜較正常人的SPARC蛋白表達(dá)量高，后囊下型和核型白內(nèi)障的晶狀體較正常人的SPARC轉(zhuǎn)錄增加[13]。另一項(xiàng)研究表明，白內(nèi)障患者的晶狀體前囊膜較正常人的SPARC蛋白表達(dá)量高，并有隨著年齡增長(zhǎng)表達(dá)增加的趨勢(shì)；氧化損傷、熱應(yīng)激處理均可使人晶狀體上皮細(xì)胞SPARC表達(dá)上調(diào)[14]。這些研究均表明，SPARC與白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

我們前期研究結(jié)果表明，用終濃度為10ng/ml的TGF-β2培養(yǎng)HLECs-B3細(xì)胞24小時(shí)，能夠使HLECs-B3細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，采用終濃度為10ng/ml的TGF-β2培養(yǎng)HLECs-B3細(xì)胞0～24小時(shí)，細(xì)胞免疫熒光法觀察SPARC表達(dá)水平變化， Western blotting法進(jìn)行定量檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證了在使用TGF-β2誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、構(gòu)建白內(nèi)障細(xì)胞模型的過(guò)程中，SPARC蛋白的表達(dá)量明顯增加。

TGF-β和SPARC的生物學(xué)作用有很多交叉，而且能夠誘導(dǎo)對(duì)方表達(dá)，但目前TGF-β和SPARC在調(diào)控上皮細(xì)胞生物學(xué)特性中的相互關(guān)系尚不明確。一項(xiàng)研究表明，SPARC影響TGF誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞的遷徙和增殖，提示SPARC和TGF誘導(dǎo)的信號(hào)通路有交叉[15]。本研究表明，TGF-β2能夠誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞SPARC表達(dá)量的增加。除晶狀體上皮細(xì)胞外，SPARC和TGF-β互相作用調(diào)控多種細(xì)胞的生物學(xué)行為，例如，在腎小球系膜細(xì)胞SPARC誘導(dǎo)TGF-β表達(dá)[16-17]，而在另外很多類型的細(xì)胞(包括內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等)TGF-β刺激SPARC的表達(dá)[18-21]。這些研究均論證了TGF-β和SPARC之間的相互作用及影響。

本研究證實(shí)了TGF-β2能夠誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞SPARC表達(dá)量的增加，提示SPARC可能在人晶狀體上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，對(duì)其作用機(jī)制的深入探討將有助于闡明SPARC對(duì)白內(nèi)障發(fā)生及發(fā)展的影響。

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