RNA干擾CD133的表達逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌細胞對化療藥物耐藥的研究

張念華 武如通 李壽杰 陳高峰

結(jié)腸癌的發(fā)病率不斷增高，是目前我國最常見的消化道惡性腫瘤，很難早期發(fā)現(xiàn)及治療，整體治療效果并不好?；熢诮Y(jié)腸癌的綜合治療中占據(jù)重要地位。然而化療過程中產(chǎn)生的多藥耐藥現(xiàn)象又會造成腫瘤治療失敗。腫瘤治療過程中，總有部分腫瘤細胞可以逃避化療藥物的殺傷，這部分殘留的腫瘤細胞隨時有可能增殖形成新的腫瘤。能夠逃避化療藥物殺傷的腫瘤細胞往往都是腫瘤干細胞。這部分細胞平時大都處于休眠狀態(tài)，化療藥物并不能有效殺滅，多程化療后往往會造成腫瘤干細胞殘留。殘留的腫瘤干細胞隨時可能再進入增殖狀態(tài)，導(dǎo)致結(jié)腸癌復(fù)發(fā)。在目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤干細胞標志物中，CD133在結(jié)腸癌干細胞中多有表達，在耐藥的結(jié)腸癌細胞中CD133的表達更是出現(xiàn)明顯上調(diào)。本研究運用RNA干擾技術(shù)下調(diào)結(jié)腸癌耐藥細胞株CD133的表達，觀察其對耐藥細胞株化療藥物敏感性的影響，以期為靶向CD133的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

lovo細胞株為人結(jié)腸癌腫瘤細胞，保存于中山大學(xué)華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室。細胞培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基，購自Gibco公司，細胞培養(yǎng)過程中加10%的胎牛血清。

1.2 實驗方法

1.2.1 人結(jié)腸癌耐藥細胞株的建立 運用藥物濃度梯度遞增間歇誘導(dǎo)法建立人結(jié)腸癌lovo細胞耐5-FU細胞株。細胞培養(yǎng)液中首先加入2 mg/l的5-FU進行培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后更換普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞重新長至對數(shù)生長期時，再次加5-FU進行誘導(dǎo)。在此過程中，不斷增加5-FU的濃度，直到獲得能在50 mg/l的5-FU濃度中穩(wěn)定生長的細胞，并命名為lovo/5-FU。平時傳代過程中，為維持其耐藥性，培養(yǎng)液中加入50 mg/l的5-FU。運用MTT法檢測結(jié)腸癌耐藥細胞株的耐藥能力，并計算半數(shù)抑制濃度(IC50)及耐藥指數(shù)。

1.2.2 CD133特異性干擾載體的構(gòu)建

CD133基因序列參考GeneBank數(shù)據(jù)庫，選取針對CD133的干擾序列構(gòu)建到慢病毒RNA干擾載體上，形成CD133特異性RNA干擾慢病毒載體。慢病毒載體中含G418抗性基因。取對數(shù)生長期的lovo/5-FU細胞，接種于12孔培養(yǎng)板中。密切觀察細胞生長情況，待細胞匯合度達80%時，利用Lipofectamine TM2000將CD133特異性RNA干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染lovo/5-FU細胞。轉(zhuǎn)染時間為6 h，轉(zhuǎn)染結(jié)束后更換為選擇培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)基中含濃度為800ug/ml的G418。繼續(xù)培養(yǎng)2周后，挑選出抗性克隆，繼續(xù)維持培養(yǎng)。

1.2.3 Western blot法分析CD133的表達

1.2.3.1 細胞總蛋白的提取及定量 將細胞上層培養(yǎng)液倒掉，經(jīng)PBS沖洗后加蛋白裂解液，收集細胞裂解液保存?zhèn)溆?。采用BSA法進行蛋白定量，根據(jù)蛋白定量結(jié)果及所需加的蛋白量計算加樣量。

1.2.3.2 加樣、跑膠及電轉(zhuǎn) 根據(jù)目的蛋白的分子量選擇相應(yīng)濃度的膠。將marker及蛋白樣品進行編號，按編號加入不同泳道。加樣結(jié)束，進行跑膠及電轉(zhuǎn)。

1.2.3.3 一抗反應(yīng)及二抗反應(yīng) 將CD133抗體以1∶2000的比例用5%脫脂奶-TBST溶液10 ml進行稀釋，將PVDF膜浸入其中，進行一抗反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，二抗用5%脫脂奶-TBST溶液稀釋至10 ml，將PVDF膜置于其中，進行二抗反應(yīng)。二抗反應(yīng)結(jié)束后，在暗房進行發(fā)光洗片。

1.2.4 細胞遷移實驗

1.2.4.1 基質(zhì)膠準備 首先將matrigel基質(zhì)膠進行融化，應(yīng)用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基將融化的，在Transwell小室上室底部鋪50μl稀釋的matrigel基質(zhì)膠。

1.2.4.2 細胞遷移 胰酶消化lovo腫瘤細胞，運用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進行重懸，調(diào)整細胞密度至1×107個/L。100 μl不含血清的細胞懸液加入Transwell小室上室，下室加入含血清培養(yǎng)基。

1.2.4.2 染色觀察 培養(yǎng)結(jié)束后取出transwell小室用PBS緩沖液漂洗2次，多聚甲醛固定細胞后，置入蘇木精溶液中染色。染色結(jié)束后，顯微鏡下觀察并計數(shù)。運用高倍視野(X 200)進行觀察，隨機選取上、下、中心、左、右5個視野，計算視野內(nèi)侵出的細胞數(shù)。

1.2.5 MTT法測定對化療藥物耐藥的逆轉(zhuǎn)作用 選擇結(jié)腸癌lovo細胞株及其對應(yīng)的耐5-FU細胞株，共設(shè)3個組：空白對照組、化療藥物組、CD133特異性RNA干擾慢病毒載體聯(lián)合化療藥物處理組。MTT法檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染CD133特異性RNA干擾慢病毒載體后，結(jié)腸癌耐藥細胞株對化療藥物的IC50值，觀察其對化療藥物耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。重復(fù)三次，根據(jù)結(jié)果計算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌耐藥細胞株的建立及耐藥能力測定

通過運用藥物濃度梯度遞增間歇誘導(dǎo)法建立人結(jié)腸癌lovo耐5-FU細胞株(lovo/5-FU)。MTT法分析lovo及l(fā)ovo/5-FU細胞株對5-FU的敏感性，結(jié)果顯示，5-FU對lovo細胞株的IC50為14.2 mg/l，對lovo/5-FU細胞株的IC50為119.5 mg/l。根據(jù)耐藥指數(shù)=子代細胞IC50(119.5 mg/l)/親代細胞IC50(14.2 mg/l)，得出耐藥指數(shù)為：8.42。

2.2 RNA干擾CD133的表達對化療藥物耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

選擇結(jié)腸癌lovo細胞株及其對應(yīng)的耐5-FU細胞株(lovo/5-FU)，共設(shè)3個組：空白對照組、化療藥物組、RNA干擾聯(lián)合化療藥物處理組。MTT法檢測經(jīng)CD133特異性RNA干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，lovo/5-FU細胞株對5-FU的IC50值為11.2 mg/l：而對照組lovo/5-FU細胞株對5-FU的IC50為119.5 mg/l。根據(jù)逆轉(zhuǎn)倍數(shù)RF=化療藥物組IC50(119.5 mg/l)/聯(lián)合用藥組IC50(11.2 mg/l)，得出逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(RF)為10.67。結(jié)果顯示：RNA干擾CD133的表達后耐藥性明顯逆轉(zhuǎn)。

2.3 Western blot法分析CD133的表達

lovo/5-FU細胞經(jīng)CD133特異性RNA干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，繼續(xù)維持培養(yǎng)48小時，加入細胞裂解液收集蛋白，運用western blot法分析CD133的表達(設(shè)lovo對照組及l(fā)ovo/5-FU對照組)。結(jié)果示：lovo/5-FU細胞CD133的表達水平顯著高于lovo細胞；運用RNA干擾lovo/5-FU細胞CD133的表達后，其CD133的表達水平明顯下調(diào)(圖1)。結(jié)果表明RNA干擾有效。

圖1 Western blot法分析CD133的表達

2.4 細胞遷移實驗分析加入中成藥后對結(jié)腸癌耐藥細胞株遷移能力的影響

取對數(shù)生長期的lovo/5-FU細胞株進行Transwell遷移實驗，遷移實驗設(shè)四組：lovo/5-FU細胞株空白對照組、5-FU組(IC20濃度)、RNA干擾組、RNA干擾加5-FU(IC20濃度)組。實驗結(jié)果顯示：lovo/5-FU細胞株空白對照組侵出小室的細胞數(shù)目最多，遷移能力最強，平均每個高倍視野內(nèi)侵出小室的細胞數(shù)為92.3±8.3個；5-FU組和RNA干擾組侵出小室的細胞數(shù)目較多，遷移能力稍弱于空白對照組，平均每個高倍視野內(nèi)侵出小室的細胞數(shù)分別為67.5±8.2個和62.3±7.9個；RNA干擾加5-FU組侵出小室的細胞數(shù)目最少，平均每個高倍視野內(nèi)侵出小室的細胞數(shù)僅有31.4±6.7個。

3 討論

結(jié)腸癌在化療過程中極易產(chǎn)生化療耐藥，產(chǎn)生的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR) 現(xiàn)象是造成化療失敗的根源。結(jié)腸癌化療失敗后，腫瘤進展極易出現(xiàn)腸梗阻，出現(xiàn)腸梗阻患者對治療的耐受性變差，預(yù)后不佳[1]。目前在結(jié)腸癌中也發(fā)現(xiàn)存在腫瘤干細胞，腫瘤干細胞具有高度自我更新能力，能夠隨時分化成增殖活躍的腫瘤細胞，造成腫瘤治療失敗，出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[2]。在腫瘤治療過程中，腫瘤干細胞可能逃避抗腫瘤藥物的殺傷，逐漸產(chǎn)生耐藥性，增殖形成新的腫瘤，新生腫瘤將會對抗腫瘤治療產(chǎn)生更強的耐受，具有更高的增殖和轉(zhuǎn)移潛能，從而導(dǎo)致腫瘤進展[3]。CD133與結(jié)腸癌腫瘤干細胞密切相關(guān)，在其中多有表達[4]。來自于結(jié)腸癌的CD133陽性腫瘤細胞具有高度的致瘤性，種植在裸鼠中能夠形成腫瘤，CD133陰性腫瘤細胞則不能形成腫瘤[5]。

本研究首先運用藥物濃度梯度遞增間歇誘導(dǎo)法建立人結(jié)腸癌lovo耐5-FU細胞株，同時構(gòu)建了CD133特異性RNA干擾慢病毒載體。Western blot法分析發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)耐藥性的lovo/5-FU細胞株較lovo細胞株CD133表達明顯上調(diào)。結(jié)腸腫瘤標本中CD133陽性表達是手術(shù)患者預(yù)后不良因素之一，同時也是接受5-FU化療患者的預(yù)后不良因素。CD133低表達患者具有更好的生存率[6-8]。lovo/5-FU細胞株在耐藥過程中出現(xiàn)CD133的表達提示預(yù)后不良。我們運用CD133特異性RNA干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染lovo/5-FU細胞株后，其CD133的表達出現(xiàn)明顯下調(diào)。伴隨著CD133的表達下調(diào)，lovo/5-FU細胞株對化療藥物的耐藥性也出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。同時細胞遷移實驗表明，經(jīng)轉(zhuǎn)染CD133特異性RNA干擾慢病毒載體后，細胞遷移能力明顯下降。這表明，運用RNA干擾下調(diào)CD133的表達能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥，提高腫瘤細胞對化療的敏感性。RNA干擾下調(diào)CD133的表達對化療具有增敏作用，在結(jié)腸癌基因治療中有望成為新的治療靶點。

腫瘤干細胞大多處于休眠狀態(tài)，傳統(tǒng)化療藥物僅能殺傷增殖活躍的腫瘤細胞，并不能有效殺滅處于休眠狀態(tài)腫瘤干細胞，這是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要原因。CD133的表達能夠預(yù)測結(jié)腸癌患者的預(yù)后，CD133低表達患者預(yù)后較好，高表達患者預(yù)后較差。CD133高表達的患者除了給予輔助化療外，還應(yīng)該考慮新的治療方法[9]。有研究表明靶向CD133的溶瘤腺病毒能夠選擇性的感染并殺死CD133陽性的結(jié)腸癌細胞[10]。我們的研究表明在結(jié)腸癌細胞株lovo細胞在對5-FU發(fā)生耐藥后，出現(xiàn)CD133的表達上調(diào)。運用RNA干擾方法抑制CD133的表達，可逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性。

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