高壓氧對(duì)FVB小鼠高架十字迷宮行為的影響

羅朝文 成金玲 張楚瑜 蕭丹賢 馮嘉欣 陳盛強(qiáng) 沈巖松 胡 楠 黃梅秀

高壓氧(hyperbaric oxygenation，HBO)治療是一種常見臨床治療手段，指機(jī)體處于高氣壓環(huán)境中呼吸純氧或高濃度氧, 以達(dá)到治療疾病目的的一種治療方法。高壓氧常用于冠心病[1]，炎癥性腸病[2]，急性腦梗死[3]和顱腦損傷[4]等眾多臨床疾病的治療，而隨著進(jìn)一步的臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，高壓氧療法對(duì)老年癡呆[5]、孤獨(dú)癥[6]等患者的腦功能的恢復(fù)和改善也能取得良好的療效。

人與動(dòng)物的行為是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)控制下的極其復(fù)雜的過程，這一過程起始于內(nèi)外環(huán)境的變化作用于相應(yīng)感覺器官，個(gè)體往往會(huì)通過外在動(dòng)作、行為和情緒表現(xiàn)出這種變化。生活環(huán)境條件的改變或受到外界環(huán)境的刺激后，人與動(dòng)物會(huì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)控制下，做出一系列的如向性、趨性、反射、本能、學(xué)習(xí)和推理等行為反應(yīng)。

在臨床實(shí)驗(yàn)方面，Rossignol，hungpaibulpatana等人[7-9]證明高壓氧療法與現(xiàn)有一些治療方法相結(jié)合能普遍提高孤獨(dú)癥患兒的社會(huì)功能；唐龍沖等[5]證明高壓氧治療有助于改善血管性癡呆患者認(rèn)知行為；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，徐曉虹等發(fā)現(xiàn)高壓氧也能改變昆明小鼠[10]、Wistar大鼠[11]的一些行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的表型，但高壓氧對(duì)FVB品系小鼠高架十字迷宮行為影響目前尚未報(bào)道。因此為進(jìn)一步明確高壓氧對(duì)于小鼠高架十字迷宮行為的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)4周齡FVB129 小鼠進(jìn)行高壓氧干預(yù)后，再進(jìn)行高架十字迷宮行為觀察，嘗試為進(jìn)一步開展高壓氧影響神經(jīng)系統(tǒng)生理機(jī)制的研究提供行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡FVB129近交系小鼠(荷蘭伊拉斯塔斯大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)及遺傳學(xué)研究中心Oostra BA教授惠贈(zèng))，廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)及繁殖，所有小鼠均遵循人道原則和廣東省及廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理飼養(yǎng)條例的要求進(jìn)行飼養(yǎng)及操作。

1.1.2 高壓氧干預(yù)設(shè)備 NG90IIIB型單人醫(yī)用高壓純氧艙廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院康復(fù)科提供。

1.1.3 十字高架迷宮材料 高架十字迷宮(自制):兩條兩側(cè)有擋板圍蔽的閉臂和兩條兩側(cè)沒有擋板圍蔽的開臂互相垂直成“十”字型交叉，裝置離地面50 cm，每條臂均長(zhǎng)30 cm、寬5 cm，閉臂擋板高15 cm，每條臂底部均涂黑。

1.1.4 動(dòng)物行為分析軟件 Smart v2.5.21(西班牙Panlab公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及高壓氧處理 實(shí)驗(yàn)使用30日齡FVB129近交系小鼠分成兩組：高壓氧組和對(duì)照組。高壓氧組小鼠處理方案為采用單人醫(yī)用高壓純氧艙進(jìn)行高壓氧干預(yù)，每次干預(yù)前用純氧洗艙10 min，然后逐漸加壓20 min至2.0ATA,穩(wěn)壓維持40 min, 期間持續(xù)純氧通風(fēng)，氧流量維持5 L/min，艙內(nèi)氧濃度在95%以上，艙內(nèi)溫度在20～25 ℃，隨后減壓10 min至1。OATA出艙, 1次/天,10天一個(gè)療程，中間間隔1天，再進(jìn)行第2個(gè)療程。對(duì)照組小鼠置于籠內(nèi)，不做任何特殊處理，單純飼養(yǎng)21天。兩個(gè)療程的高壓氧干預(yù)結(jié)束后立刻對(duì)兩組小鼠進(jìn)行高架十字迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 高架十字迷宮 實(shí)驗(yàn)開始前確認(rèn)裝置無上次實(shí)驗(yàn)留下的小鼠的糞便，是清潔、無味道的。將小鼠提前3小時(shí)左右安置于行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境，減少小鼠緊張。把高架十字迷宮放在光線充足的地方，在開臂與閉臂接合處上方安置好攝像機(jī), 并與計(jì)算機(jī)記錄系統(tǒng)相聯(lián)接，調(diào)整好錄像畫面。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將小鼠從籠內(nèi)取出，背向?qū)嶒?yàn)者，頭朝開臂放入開臂與閉臂結(jié)合處。小鼠進(jìn)入開臂與閉臂結(jié)合處后開始計(jì)時(shí)，讓小鼠在迷宮中自由活動(dòng)，使用Smart v2.5.21軟件跟蹤小鼠活動(dòng)軌跡并記錄下小鼠在高架十字迷宮中5 min 的行為表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將小鼠放回籠內(nèi)，用75%乙醇擦洗1遍迷宮并待乙醇揮發(fā)干凈，防止殘留氣味干擾下一次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用軟件分析錄像。觀察指標(biāo)：①進(jìn)入閉臂次數(shù)(Close arm Entry，CE)，進(jìn)入到任一閉臂的次數(shù)，以小鼠四個(gè)爪子均進(jìn)入臂內(nèi)為準(zhǔn)，中途一個(gè)爪子從該臂中完全退出則為該次進(jìn)入活動(dòng)完成; ②進(jìn)入開臂次數(shù)(Open arm Entry，OE)，進(jìn)入到任一開臂的次數(shù)，以小鼠四個(gè)爪子均進(jìn)入到臂內(nèi)為準(zhǔn)，中途一個(gè)爪子從該臂中完全退出則為該次進(jìn)入活動(dòng)完成;③閉臂停留時(shí)間(Close arm Time，CT)，單位: 秒; ④開臂停留時(shí)間(Open arm Time，OT)，單位: 秒; ⑤進(jìn)入閉臂路程(Close arm Tracking，CTR) ; ⑥進(jìn)入開臂路程(Open arm Tracking，OTR) 。由①～⑥分別計(jì)算出：進(jìn)入開臂和封臂的總次數(shù)(OE+CE)；進(jìn)入開臂次數(shù)比例(OE%)，即OE/(OE+CE)×100%；進(jìn)入閉臂次數(shù)比例(CE%)，即CE/(OE+CE)×100%；開臂停留時(shí)間比例(OT%)，即OT/(OT+CT)×100%；閉臂停留時(shí)間比例(CT%)，即CT/(OT+CT)×100%；進(jìn)入開臂路程比例(OTR%)，即OTR/(OTR+CTR)×100%；進(jìn)入閉臂路程比例(CTR%)，即CTR/(OTR+CTR)×100%。

圖1 高架十字迷宮試驗(yàn)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠進(jìn)入不同臂的次數(shù)

高壓氧組小鼠閉臂進(jìn)入次數(shù)及進(jìn)臂總次數(shù)較對(duì)照組小鼠顯著增加(P<0.05)。兩者開臂進(jìn)入次數(shù)無明顯差異(P>0.05)；開臂進(jìn)入次數(shù)占總進(jìn)臂次數(shù)百分比與閉臂進(jìn)入次數(shù)占總進(jìn)臂次數(shù)百分比，兩者之間無明顯差異(P>0.05)。

表1 小鼠進(jìn)入不同臂的次數(shù) 次)

注：1)與對(duì)照組比較有顯著差異，P<0.05

2.2 小鼠在不同臂的運(yùn)動(dòng)路程及總路程

與對(duì)照組相比較，高壓氧組小鼠在開臂的路程顯著減少(P< 0.05)，在閉臂的路程顯著增加(P< 0.05)，開臂總路程與閉臂總路程兩者無明顯差異(P>0.05)；高壓氧組小鼠的開臂路程占總路程百分比顯著小于對(duì)照小鼠的開臂路程占總路程百分比(P< 0.05)，高壓氧組小鼠的閉臂路程占總路程百分比顯著大于對(duì)照小鼠的閉臂路程占總路程百分比(P< 0.05)。

高壓氧組(n=9)對(duì)照組(n=13)OTR472.89±380.121)1 549.89±947.39CTR3 412.29±837.771)2 568.35±631.36OTR+CTR3 885.18±680.044 118.23±903.22OTR/ OTR+CTR(%)12.78±10.681)36.06±17.01CTR/ OTR+CTR(%)87.22±10.681)63.94±17.01

注：1)與對(duì)照組比較有顯著差異，P<0.05

2.3 小鼠在不同臂的停留時(shí)間

高壓氧組小鼠的開臂停留時(shí)間顯著小于對(duì)照小鼠的開臂停留時(shí)間(P< 0.05)，高壓氧組小鼠的閉臂停留時(shí)間顯著大于對(duì)照小鼠的閉臂停留時(shí)間(P< 0.05)；高壓氧組小鼠的開臂停留時(shí)間占各臂總停留時(shí)間百分比顯著小于對(duì)照小鼠的開臂停留時(shí)間占各臂總停留時(shí)間百分(P< 0.05)，高壓氧組小鼠的閉臂停留時(shí)間占總停留時(shí)間百分比顯著大于對(duì)照小鼠的閉臂停留時(shí)間占總停留時(shí)間百分比(P< 0.05)。

高壓氧組(n=9)對(duì)照組(n=13)OT39.88±28.231)97.00±57.62CT164.48±33.961)118.13±48.98OT/OT+CT(%)19.79±14.181)43.72±18.99CT/ OT+CT(%)80.21±14.181)56.28±18.99

注：1)與對(duì)照組比較有顯著差異，P< 0.05

注：A對(duì)照組；B高壓氧組(其中上、下為開臂區(qū)域,左、右為閉臂區(qū)域)

3 討論

動(dòng)物行為學(xué)是研究動(dòng)物的行動(dòng)舉止的科學(xué)。它不僅包括明顯的運(yùn)動(dòng)如行走跑跳和飛翔等，也包括一些身體局部的細(xì)微反應(yīng)如注目、豎耳、立毛、發(fā)聲、變色、釋放 氣味等。本能行為、學(xué)習(xí)行為、母性行為、探究行為、性行為、群體的社會(huì)行為以及行為的生理機(jī)制和遺傳發(fā)育規(guī)律等都是動(dòng)物行為學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容。個(gè)體動(dòng)物的行為表現(xiàn)既由先天所決定，又受后天經(jīng)驗(yàn)的左右。本能是遺傳貯存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的固定行為模式，而學(xué)習(xí)能通過經(jīng)驗(yàn)或練習(xí)使行為發(fā)生比較持久的臨時(shí)改變，原有的天賦不足以應(yīng)付，需用學(xué)習(xí)來修正行為反應(yīng)以達(dá)到適應(yīng)。行為學(xué)研究的深入，使人們更加了解動(dòng)物以及它們與環(huán)境的相互作用。因此人們通過各種各樣的實(shí)驗(yàn)方法的設(shè)計(jì)，從行為學(xué)、腦成像、電生理、組織化學(xué)及分子生物學(xué)角度試圖分析動(dòng)物的認(rèn)知過程，意向過程及人的人格和個(gè)性。其中認(rèn)知過程包括了感覺、直覺、注意、學(xué)習(xí)、記憶和思維，意向過程包括情緒、情感、動(dòng)機(jī)、意向、意志及意志行為等。雖然動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)不能反映微觀機(jī)制，但能觀察多因素混合作用對(duì)動(dòng)物的綜合影響，可以反映動(dòng)物整體狀態(tài)。盡管實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)的研究不斷應(yīng)用各種先進(jìn)的科技手段，從宏觀到微觀，從整體到局部，從行為到基因，不同層次的研究廣泛展開，而動(dòng)物行為學(xué)依然是研究者評(píng)估動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)變化的主要指標(biāo)。

行為學(xué)評(píng)估的內(nèi)容有很多方面，主要包括動(dòng)物的自主行為、肌力及協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)能力、學(xué)習(xí)與記憶能力等，而高架十字迷宮是評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物焦慮反應(yīng)的重要實(shí)驗(yàn)方法[12]。小鼠既有面對(duì)新事物想去探究的好奇心, 又有嗜暗的天性, 高懸的高架十字迷宮開臂如同懸崖, 易導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生恐懼，不安。利用動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探究特性和對(duì)高懸開放臂的恐懼心理，形成動(dòng)物的矛盾沖突狀態(tài)，反映動(dòng)物的焦慮情緒[13]。通過比較小鼠在開臂和閉臂內(nèi)的滯留時(shí)間和路程來評(píng)價(jià)小鼠的焦慮行為，進(jìn)臂總次數(shù)與進(jìn)入閉臂次數(shù)可以整體評(píng)價(jià)小鼠的活躍程度；小鼠進(jìn)出各區(qū)域活動(dòng)的時(shí)間和路程反映小鼠對(duì)環(huán)境的探索及興奮程度，小鼠走動(dòng)的路程越多，說明小鼠的探索行為越多，興奮性越強(qiáng)[14- 15]。本實(shí)驗(yàn)的高架十字迷宮行為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集采用攝像機(jī)拍動(dòng)物活動(dòng)的錄像，結(jié)合計(jì)算機(jī)記錄、分析系統(tǒng)，用SMART v2.5.21軟件分析錄像來處理數(shù)據(jù)，比以往人工觀察更加客觀，靈敏。本實(shí)驗(yàn)采用的計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)能動(dòng)態(tài)分析動(dòng)物在高架十字迷宮的活動(dòng)軌跡，可以客觀提取定量數(shù)據(jù)，可以更加全面地評(píng)價(jià)動(dòng)物活動(dòng)特點(diǎn)，并為病理狀態(tài)的分析提供了有用的基礎(chǔ)。

我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高壓氧能改變FVB小鼠高架十字迷宮行為的表型。其中，高壓氧組小鼠進(jìn)入閉臂次數(shù)及進(jìn)臂總次數(shù)較對(duì)照組小鼠顯著增加(P<0.05)，說明高壓氧組小鼠活力增加。與對(duì)照組相比較，高壓氧組小鼠在開臂的路程、開臂路程占總路程百分比、開臂停留時(shí)間及開臂停留時(shí)間占各臂總停留時(shí)間百分比都顯著減少(P<0.05)；而在閉臂的路程、閉臂路程占總路程百分比、閉臂停留時(shí)間及閉臂停留時(shí)間占總停留時(shí)間百分比都顯著增加(P< 0.05)，開臂總路程與閉臂總路程兩者無明顯差異(P> 0.05)，說明高壓氧組小鼠興奮性不變，對(duì)環(huán)境的認(rèn)知能力增強(qiáng)，對(duì)危險(xiǎn)情況意識(shí)增強(qiáng)，焦慮感增加，小鼠會(huì)主動(dòng)選擇“安全”閉臂，避開高懸“危險(xiǎn)”的開臂。綜上所述，經(jīng)過高壓氧干預(yù)的小鼠高架十字迷宮的行為的改變都更符合小鼠的天性，這可能更有利于其在自然界的生存。

以往的實(shí)驗(yàn)證明高壓氧有增加血漿溶解氧， 從而增加腦組織的氧供的作用[16]，劉仕成等人[17]證實(shí)高壓氧可以降低細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10 的水平，對(duì)外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)起抗炎作用從而改善孤獨(dú)癥大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育及社會(huì)行為；高壓氧治療對(duì)下調(diào)Nogo-A及NgR表達(dá)是促進(jìn)中樞神經(jīng)再生的機(jī)制之一[18]；徐淳等證實(shí)間歇高壓氧暴露可以促進(jìn)小鼠腦組織中Prx 6的含量增加，從而增強(qiáng)組織的抗氧化能力[19]；趙宏等人[20]證實(shí)高壓氧治療可有效改善缺氧缺血性腦病新生兒的氧化應(yīng)激狀態(tài)及腦血流狀態(tài)；劉岱等人[4]證實(shí)高壓氧可以有效減輕氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng),改善重型顱腦損傷患者血管內(nèi)皮細(xì)胞功能,降低顱內(nèi)壓。所以本實(shí)驗(yàn)中高壓氧干預(yù)改變正常生理狀態(tài)下FVB小鼠高架十字迷宮行為的表型,可能與其促進(jìn)腦組織的有氧代謝和能量合成,使腦組織獲得更豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的酶活性增強(qiáng),降低氧自由基、炎癥因子,進(jìn)而保護(hù)腦組織細(xì)胞功能有關(guān)。

齊玲等人[21]在2.3ATA， 2.5ATA和2.8ATA不同的高壓氧治療壓力急性一氧化碳中毒療效觀察中發(fā)現(xiàn)2.8ATA首次治療壓力可縮短中重度急性一氧化碳中毒的促醒時(shí)間,減少遲發(fā)性腦病的發(fā)生,提高治愈率；陳玉燕等人[22]在1.8ATA， 2.0ATA和2.2ATA不同壓力高壓氧對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠出血灶周圍水腫及水通道蛋白4表達(dá)的影響研究中發(fā)現(xiàn)2.0ATA壓力治療效果優(yōu)于1.8ATA及2.2ATA，而臨床實(shí)驗(yàn)證明較長(zhǎng)時(shí)間吸入 60-200 kPa 的氧氣，會(huì)導(dǎo)致肺型氧中毒，吸入 200 kPa 以上的氧氣會(huì)導(dǎo)致驚厥型氧中毒[23]，提示臨床應(yīng)用中在高壓氧的安全壓力范圍內(nèi)應(yīng)該還存在最有效壓力。

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)受溫度、光照、噪音及操作人員氣味等影響因素較多，在不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果可能有較大差異。近年來，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)合計(jì)算機(jī)數(shù)字化采樣和分析技術(shù)，可自動(dòng)記錄小鼠自發(fā)活動(dòng)的全過程，并分析其運(yùn)動(dòng)軌跡，得到一系列行為學(xué)指標(biāo)，使實(shí)驗(yàn)更加高效、客觀。過去通過目測(cè)小鼠在高架十字迷宮里的活動(dòng)過程研究小鼠行為學(xué)的傳統(tǒng)方法，只能夠計(jì)算小鼠在高架十字迷宮里進(jìn)入各個(gè)區(qū)域的次數(shù)，無法記錄小鼠的活動(dòng)軌跡，更無法目測(cè)小鼠的行動(dòng)速度、路程，而且也會(huì)因目測(cè)者主觀因素而產(chǎn)生很大的誤差，達(dá)不到滿意的空間分辨率或時(shí)間分辨率。本實(shí)驗(yàn)采用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)自動(dòng)識(shí)別小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡，并結(jié)合了計(jì)算機(jī)記錄、分析系統(tǒng)，較以往主觀定性人工觀察方法更加客觀、靈敏，可以提取客觀定量數(shù)據(jù)，可以更加全面地評(píng)價(jià)小鼠高架十字迷宮活動(dòng)特點(diǎn)，為下一步的研究提供了有用的基礎(chǔ)。高壓氧對(duì)FVB小鼠高架十字迷宮行為影響的作用機(jī)制還值得進(jìn)一步探討。

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