青藏高原垂穗披堿草種質資源遺傳多樣性的SSR分析

彭語洛,周青平,陳仕勇,陳有軍,李亞萍,田莉華

(1.西南民族大學生命科學與技術學院,四川 成都 610041; 2.西南民族大學青藏高原研究院,四川 成都 610041)

垂穗披堿草(Elymusnutans)是小麥族(Triticeae)披堿草屬(Elymus)多年生疏叢型禾草,又名鉤頭草,彎穗草，在我國東北、華北、西北、西南等地均有野生種的分布。垂穗披堿草營養(yǎng)價值高、適口性好、產草量高、耐寒、耐旱、再生性和分蘗能力強[1]、耐踐踏、耐瘠薄。近年來,隨著氣候的變化、人類的活動及草地畜牧業(yè)的發(fā)展,導致草原生態(tài)系統(tǒng)出現(xiàn)了不同程度的退化[2-3]。垂穗披堿草等物種作為青藏高原的優(yōu)勢植物在草地恢復中發(fā)揮著重要作用[4-7]。然而,現(xiàn)階段我國優(yōu)質垂穗披堿草的品種數(shù)量少,且在品質上,無法滿足當前生產所需。野生種質資源是育種的重要物質基礎[8],因此,對垂穗披堿草野生種質資源的收集、評價是當前的重要工作之一。

迄今為止,已有許多學者從不同的角度對垂穗披堿草種質資源及其近緣物種的遺傳多樣性進行了研究,包括育成品種[9-10],落粒性種質資源[11],抗旱種質資源[12],抗寒種質資源[13],耐鹽堿種質資源[14]等,其結果為垂穗披堿草種質資源的評價、保護和利用提供了參考依據。但我國垂穗披堿草種質資源數(shù)量大、種類繁多、且分布廣泛,隨著新資源數(shù)量的增加,垂穗披堿草遺傳多樣性研究需要不斷的完善和補充,以滿足育種的需求。

種質遺傳多樣性的評價,主要包括表型水平、分子水平等方面。相對于表型水平,分子水平受環(huán)境因子影響較小,重復性及穩(wěn)定性較高。因此,從分子水平對種質資源遺傳多樣性進行分析評價,可靠性更高。近年來,國內外眾多學者采用SRAP標記、RAPD標記、醇溶蛋白技術等對垂穗披堿草種質資源的遺傳多樣性進行了研究,陳智華等[15]用SRAP標記對采自四川、青海、甘肅、新疆的垂穗披堿草種質進行了多態(tài)性分析;鄧竹佳等[16]采用RAPD標記對來自川西北高原的垂穗披堿草進行了遺傳多樣性和遺傳關系分析;馬嘯等[17]對采自新疆、青海、四川、西藏的垂穗披堿草種質進行了醇溶蛋白多樣性分析。但利用SSR分子標記研究垂穗披堿草種質資源多樣性的報道較少。SSR(simple sequence repeats)分子標記既具有PFLP標記共顯性遺傳的優(yōu)點,又具有RAPD標記操作簡單,DNA用量少等優(yōu)點,是一種進行遺傳多樣性研究理想的分子標記[18-19],目前已廣泛應用于披堿草屬遺傳多樣性的研究[20-23]。為了發(fā)掘優(yōu)異性狀的種質資源,補充對垂穗披堿草種質資源的研究,本研究擬采用SSR分子標記對以青海省為主的30份垂穗披堿草種質資源遺傳多樣性進行研究,旨在為垂穗披堿草野生種質資源的保護、評價及新品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

30份野生垂穗披堿草種質材料采自青海、四川、西藏3省,其中25份采自青海、3份來自四川、2份采自西藏,編號采集地情況如表1所列。30份種質材料種植于西南民族大學青藏高原研究院牧草種質資源圃,并對其進行了形態(tài)學鑒定。

1.2 試驗方法

1.2.1基因組DNA的提取及檢測 隨機選取每份垂穗披堿草種質材料的30粒種子,播于試驗盆中,置于RXZ型多段可編程智能人工氣候箱(寧波江南),條件為白天22 ℃/16 h,夜間18 ℃/8 h,光照強度為500 mmol·(m2·s)-1,相對濕度為70%,生長至三葉期時,每份材料取10～15個單株新鮮健康的葉片均勻混合[24],用液氮研磨成粉,采用植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)(北京天根生化)提取基因組DNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(Nano DropTMLite,Thermo)檢測其濃度和純度。

1.2.2引物篩選及SSR分析 根據已開發(fā)的披堿草屬的EST-SSR引物序列[25],從中挑選出40對引物(由南京金斯瑞合成)。選擇4份質量較高且田間表形性狀差異較大的種質材料的基因組DNA對40對引物進行擴增(JY-96G型基因擴增儀)篩選,從中選取能夠擴增出清晰條帶、多態(tài)性好、穩(wěn)定性較高的引物用作SSR的研究。

SSR-PCR反應體系和程序。PCR反應體系:總體積20 μL,2×Es Tap MasterMix(Dye)10 μL,1 μL上游引物,1 μL下游引物,2 μL DNA模板,其余由ddH2O補充。PCR擴增程序為94 ℃預變性3 min,94 ℃變性60 s,50～59 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,共35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。擴增產物采用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,1×TBE電極緩沖液,250 V電壓預電泳15 min,上樣量10 μL,400 V電壓恒壓電泳1.5 h。電泳結束后,用蒸餾水漂洗凝膠,用染色液(0.1%AgNO3)染色14 min、顯影液(0.19 g四硼酸鈉+15 g NaOH+400 mL甲醛)顯影直至條帶清晰并用數(shù)碼相機拍照保存。

表1 供試材料Table 1 Wild E. nutans accessions analyzed in this study

1.2.3統(tǒng)計與分析 根據SSR產物銀染顯影結果,統(tǒng)計SSR擴增條帶,按在相同遷移位置上有無條帶進行記錄,有擴增條帶的記為1,沒有擴增條帶的記為0,由此構建0/1二元數(shù)列矩陣,記錄引物擴增條帶的信息含量,統(tǒng)計總擴增條帶數(shù)(total number of bands,TNB)、多態(tài)性條帶數(shù)(number of polymorphic bands,NPB)、多態(tài)位點百分率(percentage of polymorphic bands,PPB)及多態(tài)性信息含量指數(shù)(polymorphic information content,PIC)。利用NTSYSpc2.10[26]數(shù)據分析軟件進行材料間的Dice遺傳相似系數(shù)(genetic similarity coefficients,GS)的計算,并按非加權組平均數(shù)方法(unweighted pair group method using arithmetic averages,UPGMA)進行聚類分析及主成分分析;采用STRUCTUREV2.3.4軟件進行群體遺傳結構分析[27]。

2 結果與分析

2.1 SSR引物的篩選及多態(tài)性

檢測結果顯示,30份垂穗披堿草種質材料的DNA提取質量較高。在選擇4份質量較高的垂穗披堿草種質材料的基因組DNA對40對引物進行篩選時,共篩選出了16對條帶清晰、多態(tài)性較高的SSR引物(表2)。16對SSR引物擴增結果表明:30份垂穗披堿草共檢測到116個等位基因位點,每對引物擴增出的位點變幅為5～15個,每對引物擴增出的平均位點數(shù)為7.25個;其中92個多態(tài)性位點,引物平均的多態(tài)性比率(PPB)為79.75%。每對引物擴增出的多態(tài)性位點變幅為3～11個,每對引物擴增出的多態(tài)性平均位點數(shù)為5.75個,引物Elw0300s019擴增出的多態(tài)性位點數(shù)最少,為3個,引物Elw3603s196擴增出的多態(tài)性性位點數(shù)最多,為11個(表3)，引物Elw3264s184的擴增結果如圖1所示。引物的多態(tài)性信息含量PIC值變化為0.063(Elw2202s122)～0.325(Elw1420s081),平均值為0.188。這些信息表明,引物Elw0669s043、Elw1197s069、Elw1420s081及Elw5540s317的多態(tài)性較好、PIC值較高,可用于日后與垂穗披堿草相關的研究。

表2 SSR引物序列及名稱Table 2 Sequences and names of SSR primer pairsy

圖1 引物Elw3264s184部分材料擴增結果Fig. 1 Amplification of the sample material using the Elw3264s184 primer

材料編號與表1中材料編號相同(圖為15 ～30號)。下同。

The code of samples is consistent with code in Table 1(the figure is code 15～30); similarly for the following figures.

表3 16對SSR引物在30份供試垂穗披堿草種質材料上的PCR擴增結果Table 3 Amplification results of the 16 SSR primers on the 30 E. nutans accessions

2.2 遺傳相似系數(shù)分析

基于16對SSR引物構建的0/1原始數(shù)據矩陣,通過數(shù)據分析軟件NTSYS-pc2.10 計算出30份供試材料間的相似系數(shù)。研究結果顯示,30份垂穗披堿草種質資源的遺傳相似系數(shù)值變幅為0.692～0.977,平均值為 0.828,其中來自海西烏蘭縣的I-1-1-13與來自海南共和縣的I-1-1-33的相似系數(shù)最小,為 0.692,表明他們之間存在較大的遺傳差異,親緣關系最遠;來自海南共和縣的I-1-1-38與來自海北三角城種羊場I-1-1-39的相似系數(shù)最大,為0.976,表明這兩份材料親緣關系最近。這些結果表明,供試材料之間差異明顯,遺傳多樣性較豐富。

2.3 聚類及群體遺傳結構分析

對30份垂穗披堿草種質資源進行聚類分析(圖2)。聚類分析結果表明,在遺傳相似系數(shù)0.804處,30份種質材料可聚為四大類,其中有24份材料包含在第Ⅰ大類中,包括20份采自青海的材料,2份采自西藏的材料和2份采自四川的材料。在相似系數(shù) 0.832處,可將第Ⅰ大類劃分為 4 個亞類,第1亞類包含5份材料,其中2份來自果洛,1份來自海南,1份來自海西,1份來自黃南;第2亞類的組成比較混雜包含了17份材料,4份是采自果洛,6份是采自海南,2份采自海北,1份采自海西,其中還包括采自西藏工布達江的2份材料(09-292和09-302)和2份采自四川松潘的材料(14-15-15和14-11-25);第3亞類和第4亞類分別只包括1份材料,分別是來自西寧湟源縣的I-1-1-17和來自果洛久治縣的I-1-1-28。第Ⅱ類包括3份采自海南和1份采自海西的材料。第Ⅲ類僅包括1份材料,來自四川松潘的14-11-22。來自海西蒙古族藏族自治州天俊縣的(09-214)單獨聚為第Ⅳ類(100%支持率),說明這份材料的遺傳背景與其他材料存在較大的差異,親緣關系較遠,表現(xiàn)出遺傳特異性,這與其形態(tài)學的特異性相一致,形態(tài)學表現(xiàn)出植株高大,葉量豐富,穗狀花序較長等特點。

圖2 基于SSR標記的30個供試材料的UPGMA聚類圖Fig. 2 Dendrogram constructed from a UPGMA, based on SSR marker for 30 E. nutans accessions

圖3 30份垂穗披堿草種質群體遺傳結構分析(K=2)Fig. 3 The genetic structure analysis of 30 E. nutans accessions ased on SSR analysis(K=2)

1，2，3，…30表示材料序號，同表1，圖4同。

1，2，3，…30 indicate accession code in Table 1, similarly for the Fig. 4.

基于SSR數(shù)據對供試30份垂穗披堿草進行了群體遺傳結構分析。當K=2時，△lnP(D)具有明顯的峰值,是最適合的群體劃分K值(圖3)。大部分材料的遺傳背景較為單一，群體劃分的結果與聚類分析的結果部分保持一致，同時也表明本研究中的供試材料的遺傳背景與其地理來源沒有明顯的相關性。

2.4 主成分分析

基于遺傳相似系數(shù)對全部供試垂穗披堿草種質資源進行主成分分析，其中前3個主成分的貢獻率分別是82.39%、2.32%和1.90%。主成分分析三維散點圖(圖4)更為直觀地反映其遺傳親緣關系,位置相靠近者表示親緣關系近,遠離者表示親緣關系遠。30份供試垂穗披堿草種質資源主成分分析結果與聚類分析結果基本一致。

圖4 30份垂穗披堿草種質材料依據SSR的三維主坐標分析Fig. 4 The plot of principal coordinates analysis of 30 E. nutans accession based on SSR analysis

3 討論

3.1 垂穗披堿草種質資源的遺傳多樣性

作為挖掘種質資源利用深度和廣度強有力的手段,分子標記已成為目前評價植物遺傳多樣研究的主流。目前不同類型的遺傳標記已廣泛應用于披堿草屬種質資源的遺傳評價、種間關系、遺傳圖譜的構建[28-30]。對垂穗披堿草遺傳多樣性進行研究,可對該物種種質資源的保護利用及新品種的選育起到補充作用。本研究用SSR標記技術得到垂穗披堿草的多態(tài)性比率(PPB)為79.75%,低于陳智華[31]用SSR標記對67份垂穗披堿草種質進行多樣性分析99.4%的多態(tài)性比率,也低于鄢家俊等[32]采用SSR標記技術對青藏高原52份老芒麥(E.sibiricus)進行遺傳多樣性分析86.44%的多態(tài)性比率。其原因一方面可能是由于本研究采用的是DNA單株混合提取,從而掩蓋了種質內的遺傳變異,導致決定種質間遺傳關系的多態(tài)性位點數(shù)降低;另一方面本研究供試材料樣本數(shù)量有限且采集的地理范圍狹窄(主要采自青海),各材料間基因存在一定的交流。但高于張成林等[33]采用SSR標記對10份垂穗披堿草種質進行遺傳多樣性分析41.77%的多態(tài)性比率,吳昊等[34]采用SSR標記技術對35份老芒麥野生資源進行分析76.99%的多態(tài)性比率。本研究利用16對SSR引物在30份垂穗披堿草種質中共擴增出了116個等位基因,其中92個多態(tài)性位點,每對引物擴增出的平均位點數(shù)為7.25個,說明了SSR分子標記對垂穗披堿草多樣性研究是非常有效的,具有多態(tài)性高的特點。多態(tài)性信息(PIC)含量為0.063～0.325,平均值為0.188,說明了供試材料間變異程度高。

3.2 供試材料間及地理來源的關系

根據已報道的垂穗披堿草遺傳評價結果表明,在大空間尺度條件下,野生的垂穗披堿草種質表現(xiàn)出明顯的遺傳和地理分化[35]。陳智華[31]、苗佳敏等[36]研究表明,我國西部的垂穗披堿草中來自新疆和青藏高原的垂穗披堿草分化明顯,其中青藏高原地區(qū)的四川、西藏、青海等地區(qū)也存在地理分化。在本研究中,根據聚類、群體結構及主成分等分析表明供試材料的聚類與其地理來源表現(xiàn)出的相關性較低,這可能由于本研究中的材料基本上來自青海各地,具有較為相似的氣候及生境條件。這也表明垂穗披堿草在小尺度條件下的變異與其地理來源相關性不高。所以,不同尺度的材料研究更能全面地反映該物種的遺傳變異信息,本研究為垂穗披堿草遺傳多樣性的研究提供了補充。

4 結論

采用SSR標記對30份野生垂穗披堿草種質資源進行研究,16對引物共獲得了116個等位基因位點,92個多態(tài)性位點,多態(tài)性位點率(PPB)為 79.75%,多態(tài)性信息(PIC)含量為0.063～0.325,平均值為0.188,說明了SSR標記在垂穗披堿草多樣性研究中是非常有效的,具有多態(tài)性高的特點。種質材料間存在較大的差異,遺傳多樣性較豐富,部分材料(09-214)表現(xiàn)出相對獨立的特性,可為垂穗披堿草保護和利用、新品種的選育及優(yōu)良基因的挖掘提供參考依據。在今后深入展開對垂穗披堿草資源的研究時,不僅要注重樣本數(shù)量的豐富度,還要充分注重材料地理來源的多樣性,充分發(fā)掘野生種質的遺傳潛力。

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