不同類型乳酸菌添加劑對燕麥青貯品質和有氧穩(wěn)定性的影響

賈婷婷，吳 哲，玉 柱

(中國農業(yè)大學動物科技學院，北京 100193)

燕麥(Avenasativa)是一種營養(yǎng)價值豐富的一年生禾谷類作物，在食品加工和飼料生產(chǎn)中都發(fā)揮著重要作用[1]。通過青貯的方式貯藏飼料作物，能夠有效保存作物原料的營養(yǎng)成分。在不使用添加劑的情況下，原料上附著微生物在發(fā)酵過程中起主導作用，往往引起青貯飼料的干物質損失及蛋白質水解[2]。因此，添加劑特別是乳酸菌制劑常作為青貯發(fā)酵促進劑添加到青貯飼料中，乳酸菌添加劑能夠增加青貯早期乳酸菌數(shù)量，快速生成乳酸降低青貯飼料的pH，改善青貯發(fā)酵品質。全株玉米(Zeamays)青貯中添加乳酸菌制劑可明顯降低玉米青貯飼料的pH、氨態(tài)氮和丁酸含量，提高乳酸和總酸含量[3]；乳酸菌接種劑可以降低苜蓿(Medicagosativa)青貯飼料的pH，改善青貯發(fā)酵品質[4-5]。有關燕麥青貯的研究集中于燕麥不同生育時期及不同燕麥品種間青貯品質的差異[6]，不同含水量、切斷長度、貯藏時間和貯藏方式對燕麥青貯飼料的影響[7-10]，及添加玉米粉、尿素和復合乳酸菌制劑對燕麥青貯品質的影響[7]。而有關不同類型乳酸菌制劑對燕麥青貯品質特別是有氧穩(wěn)定性的影響尚未見報道。

燕麥青貯飼料使用不同的乳酸菌添加劑，其青貯品質和有氧穩(wěn)定性可能存在差異。因此，本研究在燕麥青貯中添加植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，LP)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus，LR)和布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri，LB)，研究這3種乳酸菌添加劑對燕麥青貯飼料發(fā)酵品質、營養(yǎng)成分和有氧穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地點位于內蒙古自治區(qū)中部的阿魯科爾沁旗，地理坐標為43°21′43″-45°24′20″ N，119°02′15″-121°01′00″ E，海拔約430 m，年平均溫度5.5 ℃左右，年均日照時數(shù)2 760～3 030 h，年均積溫2 900～3 400 ℃·d，極端最高氣溫40.6 ℃，極端最低氣溫-32.7 ℃，年均降水量為300～400 mm，無霜期95～140 d，屬溫帶大陸性氣候。

1.2 試驗設計

青貯燕麥原料品種為壩莜1號，種植于內蒙古自治區(qū)阿魯科爾沁旗，2017年7月底播種，灌漿期收割后萎蔫3 h，用切碎機切至2 cm左右，將切碎混勻的燕麥原料，分別添加植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和布氏乳桿菌(均由中國農業(yè)大學動物科技學院青貯實驗室篩選研制)，并設置不添加菌劑的對照組(CK)，菌液按每克鮮草1×106cfu添加，對照添加等量蒸餾水，充分混合均勻后裝入1 L青貯罐，裝填密度為750 kg·m-3。每處理設置3個重復，于室溫(20～30 ℃)下貯藏45 d。另取3份原料樣品，于65 ℃下烘干至恒重，粉碎過0.425 mm篩后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測定方法

1.3.1發(fā)酵品質測定 發(fā)酵45 d后，開啟燕麥青貯罐，取20 g燕麥青貯飼料，加入180 mL蒸餾水后用組織搗碎機攪碎1 min。然后先用4層紗布濾去大部分草渣，再用定性濾紙過濾，得到的浸出液用來測定pH、有機酸和氨態(tài)氮含量。pH采用pH計(Five Easy plus, FE28)測定。用SHIMADZE-10A型高效液相色譜分別測定燕麥青貯飼料的乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)和丁酸(butyric acid，BA)含量，色譜柱為Shodex Rspak KC-811 S-DVB gel Column 30 mm×8 mm，柱溫50 ℃，檢測器為SPD-M10AVP，流動相為3 mmol·L-1高氯酸，檢測波長210 nm，進樣量5 μL[11]。氨態(tài)氮采用苯酚-次氯酸鈉比色法進行測定[12]。

1.3.2微生物組成測定 取燕麥青貯飼料鮮樣20 g，加入180 mL滅菌的生理鹽水，從10-1連續(xù)梯度稀釋到10-7，測定燕麥青貯飼料中的乳酸菌、酵母菌、霉菌和腸細菌數(shù)量，乳酸菌和腸細菌分別采用MRS和伊紅美藍固體培養(yǎng)基進行計數(shù)，37 ℃厭氧培養(yǎng)2 d，酵母菌和霉菌采用孟加拉紅培養(yǎng)基，在28 ℃下培養(yǎng)3～5 d后計數(shù)[13]。

1.3.3營養(yǎng)成分測定 燕麥青貯罐開啟后隨機取青貯飼料樣品，65 ℃烘48 h，后粉碎過0.425 mm篩后保存于自封袋中。然后測定燕麥原料和青貯料的干物質(dry matter，DM)、粗蛋白(crude protein，CP)、可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate，WSC)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)和淀粉(starch)含量。燕麥原料和青貯樣的CP含量采用楊勝[14]的方法測定，用蒽酮-硫酸比色法測WSC和淀粉含量[15-16]，用范式洗滌纖維法測定NDF和ADF含量[17]。

1.3.4有氧穩(wěn)定性測定 青貯飼料開啟后，將剩余青貯飼料約500 g混勻后置入1 L聚乙烯罐中，插入溫度記錄儀(SMOWO MDL-1048A)探頭，測定青貯飼料溫度和環(huán)境溫度，用青貯飼料溫度與環(huán)境溫度相差2 ℃時需要的時間來評定青貯飼料的有氧穩(wěn)定性[18]。在有氧暴露時間為1、3、5、7 d時，取20 g青貯飼料測定pH，另取20 g測定有氧暴露過程中酵母菌數(shù)量的變化。

1.4 統(tǒng)計分析

用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行整理，用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件中的Duncan’s多重比較法對不同乳酸菌添加劑處理間的差異性進行比較分析。

2 結果

2.1 燕麥原料的營養(yǎng)成分及其表面附著微生物組成

青貯發(fā)酵前燕麥干物質含量為35.83%，粗蛋白含量為12.41%，可溶性碳水化合物含量為7.79%，乳酸菌數(shù)目接近5 lg cfu·g-1，腸細菌數(shù)目大于5 lg cfu·g-1(表1)。

2.2 乳酸菌添加劑對燕麥青貯飼料發(fā)酵品質的影響

乳酸菌添加劑顯著影響營養(yǎng)燕麥青貯飼料的發(fā)酵品質(P<0.05)(表2)。與對照組相比，處理組pH顯著降低，其中添加鼠李糖乳桿菌處理的燕麥青貯飼料pH在所有處理中最低(P<0.05)；3種乳酸菌添加劑處理的燕麥青貯飼料LA含量顯著高于對照(P<0.05)，AA含量以添加布氏乳桿菌的處理最高，PA含量對照組顯著高于添加乳酸菌處理(P<0.05)；添加乳酸菌處理的NH3-N∶總氮含量顯著低于對照(P<0.05)；LA∶AA值以添加布氏乳桿菌的處理最低，顯著低于添加鼠李糖乳桿菌的處理(P<0.05)。

2.3 乳酸菌添加劑對燕麥青貯飼料微生物組成的影響

乳酸菌添加劑顯著影響燕麥青貯飼料的微生物組成(P<0.05)(表3)。乳酸菌數(shù)量以添加植物乳桿菌的處理最高，顯著高于對照及其他處理(P<0.05)；對照和添加布氏乳桿菌處理均未檢測到酵母菌，添加植物乳桿菌處理的酵母菌數(shù)量顯著高于添加鼠李糖乳桿菌處理的酵母菌數(shù)量(P<0.05)；對照及其他處理均未檢測到霉菌；腸細菌數(shù)量以添加植物乳桿菌的處理最高，顯著高于對照和其他處理(P<0.05)。

表1 燕麥原料的營養(yǎng)成分及其表面附著微生物組成Table 1 The nutrient and microbial composition of Avena sativa before ensiling

ND代表未檢測到，下同。CP、NDF、ADF、HC、WSC和Starch含量計算以干物質為基礎。

ND represent no detected; CP, NDF, ADF, HC, WSC, and Starch were calculated based on dry matter; similarly for the following tables.

2.4 乳酸菌添加劑對燕麥青貯飼料營養(yǎng)成分的影響

乳酸菌添加劑對燕麥青貯飼料的干物質、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、半纖維素和淀粉含量均沒有顯著影響(表4)，對燕麥青貯飼料的可溶性碳水化合物含量影響顯著，具體表現(xiàn)為植物乳桿菌和布氏乳桿菌處理組的可溶性碳水化合物含量顯著高于對照和鼠李糖乳桿菌處理組(P<0.05)。

2.5 乳酸菌添加劑對燕麥青貯飼料有氧穩(wěn)定性的影響

乳酸菌添加劑明顯影響燕麥青貯飼料的有氧穩(wěn)定性(圖1)。對照和添加布氏乳桿菌處理的有氧穩(wěn)定時間超過168 h，顯著高于添加植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的處理(P<0.05)。隨有氧暴露天數(shù)的增加，對照和添加布氏乳桿菌處理的pH變化平穩(wěn)，基本維持在4.0左右，添加植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌處理的pH在前3 d較穩(wěn)定，至5 d開始，pH上升至7以上。隨有氧暴露天數(shù)的增加，酵母菌的數(shù)量總體呈逐漸上升的趨勢，其中添加植物乳桿菌處理的酵母菌數(shù)量始終高于其他處理，且其酵母菌數(shù)量在3 d時迅速上升，酵母菌數(shù)量較低的為對照和添加布氏乳桿菌的處理。

同行不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，CK，未添加乳酸菌對照組；ND,未檢測到；下表同。所有指標計算以干物質為基礎。

Values in same line with different lowercase letters show significant differences among treatments at the 0.05 level; CK, no addition; LP,Lactobacillusplantarum; LR,Lactobacillusrhamnous; LB,Lactobacillusbuchneri; ND, undetected; similarly for the Table 3 and Table 4. All the parameters were calculated based on dry matter.

表3 乳酸菌添加劑對燕麥青貯飼料微生物組成的影響Table 3 Effect of Lactobacillus inoculants on microbial composition of Avena sativa silages

所有指標計算以鮮重為基礎。

All the parameters were calculated based on fresh weight.

表4 乳酸菌添加劑對燕麥青貯飼料營養(yǎng)成分的影響Table 4 Effect of Lactobacillus inoculants on nutrient composition of Avena sativa silages

所有指標計算以干物質為基礎。

All the parameters were calculated based on dry matter.

圖1 乳酸菌添加劑對燕麥青貯飼料有氧穩(wěn)定性的影響Fig. 1 Effect of lactobacillus inoculants on aerobic stability of Avena sativa silages

CK，無添加對照組；LP，植物乳桿菌；LR，鼠李糖乳桿菌；LB，布氏乳桿菌。不同小寫字母表示不同添加劑間差異顯著(P<0.05)。

CK, no addition; LP,Lactobacillusplantarum; LR,Lactobacillusrhamnous; LB,Lactobacillusbuchneri. Different lowercase letters indicate significant difference among different addition treatments at the 0.05 level.

3 討論

經(jīng)45 d發(fā)酵，燕麥青貯飼料的pH值均降至4.2以下，達優(yōu)等質量,這可能與燕麥青貯原料表面附著乳酸菌數(shù)量足夠且發(fā)酵底物充足有關。對燕麥青貯飼料分別添加植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和布氏乳桿菌后，pH下降明顯，顯著低于對照，說明乳酸菌添加劑能夠有效地降低燕麥青貯飼料的pH，改善發(fā)酵品質。這與前人有關乳酸菌處理組的pH顯著低于無添加劑處理組的研究結果相似[5,19]，植物乳桿菌降低了青貯料的pH[20-22]。此外，pH是青貯過程中酸類物質特別是乳酸積累情況的反映[23]，本研究中,添加3種乳酸菌明顯促進了燕麥青貯飼料中乳酸的生成，且添加布氏乳桿菌明顯的增加了乙酸含量，降低了乳酸∶乙酸的比值，因布氏乳桿菌是異型乳酸菌，除代謝產(chǎn)生大量乳酸外，還產(chǎn)生較多乙酸[24]。添加3種乳酸菌后，燕麥青貯飼料中的丙酸含量明顯低于對照，各處理均未檢測到丁酸，這可能是因為燕麥青貯飼料pH的降低，酸類物質的積累抑制了有害微生物梭菌，因丁酸是梭菌等有害微生物分解青貯料中糖分所產(chǎn)生的。氨態(tài)氮含量是青貯飼料中蛋白質及氨基酸分解程度的反映，本研究中添加3種乳酸菌均顯著降低了燕麥青貯飼料中的氨態(tài)氮濃度，這說明添加3種乳酸菌能明顯的抑制燕麥青貯飼料蛋白質的分解，因pH影響青貯飼料中蛋白分解酶的活性，且在低pH下植物蛋白酶的活性受到抑制，燕麥青貯飼料中3種乳酸菌制劑的使用降低了青貯料的pH，抑制了蛋白質的分解，減少了氨態(tài)氮的含量[2]。

添加3種乳酸菌對燕麥青貯飼料的干物質、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、半纖維素和淀粉含量影響不大，但顯著影響了燕麥青貯飼料的可溶性碳水化合物。青貯過程中，可溶性糖是乳酸菌發(fā)酵的物質基礎，是青貯過程中的主要來源，本研究中植物乳桿菌和布氏乳桿菌處理組保留的WSC含量較高，這可能是因為乳酸菌添加能在發(fā)酵初期迅速降低青貯飼料的pH，從而減少不良微生物對WSC的消耗。

青貯飼料暴露于空氣中后，打破了青貯體系中的厭氧狀態(tài)，好氧微生物如酵母菌等開始活躍。青貯飼料的腐敗變質一般因酵母菌增殖而引起，隨酵母菌消耗乳酸，飼料的pH升高，霉菌逐漸恢復活性，最后導致飼料腐敗變質。當青貯飼料中酵母菌數(shù)目高于5 lg cfu·g-1時，青貯飼料易發(fā)生腐敗變質[23]。本研究中在植物乳桿菌處理組，酵母菌數(shù)量高于5 lg cfu·g-1，飼料中含有大量的乳酸，其暴露在空氣中溫差上升2 ℃的時間在所有處理中最短，隨有氧暴露時間的延長，其pH和酵母菌數(shù)量迅速上升，因植物乳桿菌為同型發(fā)酵乳酸菌，其主要發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，而乳酸抗真菌能力不強[25]，因此有氧穩(wěn)定性差，燕麥青貯飼料發(fā)生腐敗。而布氏乳桿菌為異型發(fā)酵乳酸菌，能將青貯過程中產(chǎn)生的乳酸分解為乙酸，乙酸具有較強的真菌抑制能力[26-27]，因此,添加布氏乳桿菌的燕麥青貯飼料有氧穩(wěn)定性較好；然而，值得注意的是,對照組的有氧穩(wěn)定時間也超過168 h，這可能是因為對照組有最高的丙酸和較高的乙酸含量，丙酸和乙酸有利于改善青貯飼料的二次發(fā)酵[28]，也可能是因為附著于牧草表面的乳酸菌主要為異型發(fā)酵菌[29]。

4 結論

添加3種乳酸菌添加劑均能顯著改善燕麥青貯飼料的發(fā)酵品質；添加植物乳桿菌和布氏乳桿菌能保留較多的燕麥青貯飼料WSC含量；對照組和添加布氏乳桿菌處理的有氧穩(wěn)定性較優(yōu)。

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