金線蓮組織培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展

楊成行，李曉婷，袁建振，馬 清

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

金線蓮 (Anoectochilusroxburghii)為蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬多年生草本植物，主要分布于福建、浙江、廣東、海南、臺(tái)灣等東南沿海省(區(qū))及貴州、四川、湖南、云南、西藏等內(nèi)陸地區(qū)[1]。金線蓮作為珍惜名貴中草藥，其藥性平和，常用于治療幼兒發(fā)熱、急性腎炎等疾病[2-4]，在民間有“金耳環(huán)”、“鳥人參”、“金錢草”等美譽(yù)[5]；此外，由于金線蓮株形小巧優(yōu)美，葉脈金黃、呈網(wǎng)狀排列，常作為高端盆栽，或與蘭草(Eupatoriumfortunei)等盆景鑲嵌搭配，是名貴的室內(nèi)觀葉、觀花盆栽珍品[6]。因此，金線蓮具有極高的藥用價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2,6]。金線蓮屬于典型的陰生植物，零星分布于陰蔽闊葉林下肥沃的腐植土中，對生長環(huán)境要求嚴(yán)格，自然環(huán)境下難以大量繁殖[7]；加之近年來自然環(huán)境惡化以及私采濫挖泛濫，導(dǎo)致其野生資源瀕臨滅絕[8]。目前，利用組織培養(yǎng)技術(shù)快繁植株，不僅有利于解決野生金線蓮資源緊缺問題，而且對于該物種的種質(zhì)資源保護(hù)也發(fā)揮了積極的作用。為此，從外植體的選擇、愈傷及芽的誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)等方面對金線蓮組織培養(yǎng)快繁體系進(jìn)行綜述，以期為相關(guān)科研工作者和生產(chǎn)者提供參考。

1 外植體的培養(yǎng)

1.1 外植體的選擇

外植體的選擇是影響植物組織培養(yǎng)成功與否的重要因素，不同植物的不同外植體建立組織培養(yǎng)快繁體系難易不同[9-10]。金線蓮組織培養(yǎng)外植體材料通常有種子[11]、具節(jié)莖段[12-14]、莖尖[14-15]、莖片[16-17]與葉片[14]等，各自經(jīng)過相應(yīng)的滅菌方法，建立無菌體系。

1.2 消毒處理

植物組培過程中的三大難題之一即菌類污染，降低污染率是建立植物組織培養(yǎng)快繁體系的前提[18]。蘭科植物組織培養(yǎng)常用的外植體消毒試劑有75%酒精、0.1%升汞、次氯酸鈉、10%次氯酸鈣、飽和漂白粉溶液以及吐溫等[19-20]。目前，金線蓮組培消毒配合使用75%酒精和0.1%的升汞，能有效降低種子污染率。先加入75%的酒精浸泡30～60 s，用無菌水沖洗3次，再用0.1%的升汞溶液消毒15～20 min，最后用無菌水沖洗5次，可使滅菌率達(dá)到100%，且種子萌發(fā)生長良好[21-22]。

1.3 基本培養(yǎng)基的選擇

基本培養(yǎng)基是植物生長發(fā)育的主要能量來源，篩選合適的基本培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)成功的基礎(chǔ)。目前金線蓮組培試驗(yàn)使用的基本培養(yǎng)基有MS、1/2MS、N6、B5、VW等[23-24]，其中，MS培養(yǎng)基對于金線蓮愈傷組織生長的促進(jìn)作用優(yōu)于其他培養(yǎng)基[25]，這可能是由于MS培養(yǎng)基相較于B5培養(yǎng)基含有更全面的營養(yǎng)成分。目前除了較為通用的MS基本培養(yǎng)基外，還有營養(yǎng)成分全減半的1/2MS基本培養(yǎng)基[26]和大量元素減少、微量元素增加的改進(jìn)配方[16]。

2 金線蓮組織培養(yǎng)體系

金線蓮組織培養(yǎng)體系的建立一般通過3條途徑：一是由外植體脫分化形成愈傷組織，再誘導(dǎo)愈傷組織分化形成不定芽，之后將不定芽進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)使其形成大量叢生芽，最后誘導(dǎo)生芽愈傷組織產(chǎn)生不定根形成新的幼苗[27]；二是誘導(dǎo)帶節(jié)莖段直接長出腋芽或頂芽，再對其二次繼代培養(yǎng)，最后進(jìn)行生根培養(yǎng)[28]；三是在無菌條件下誘導(dǎo)種子萌發(fā)或通過莖尖、莖段等外植體產(chǎn)生原球莖，再由原球莖分化，進(jìn)而獲得完整幼苗[26]。其中，以原球莖和帶節(jié)莖段出芽兩種方式進(jìn)行增殖憑借耗時(shí)短、技術(shù)簡便的優(yōu)勢成為金線蓮大規(guī)模快繁的主流[29](表1)。

表1 金線蓮組織培養(yǎng)快繁途徑Table 1 Tissue culture fast propagation route of Anoectochilus roxburghii

2.1 原球莖分化成芽

金線蓮原球莖的誘導(dǎo)與分化不僅與培養(yǎng)基組成相關(guān)，還與植株基因型有關(guān)[31]。在對金線蓮原球莖的增殖進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，選擇合適的基本培養(yǎng)基能明顯促進(jìn)原球莖的增殖，其中以B5培養(yǎng)基效果最優(yōu)，且附加一定量的天然有機(jī)物也有利于增殖，如加入椰汁培養(yǎng)45 d后原球莖重量平均增加6倍以上[24]。劉丹[26]卻發(fā)現(xiàn)，MS更適合于金線蓮原球莖的分化培養(yǎng)。楊柏云等[30]也認(rèn)為，MS基本培養(yǎng)基更適合金線蓮原球莖的分化培養(yǎng)，并且以金線蓮莖段為外植體，添加不同濃度的6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)、NAA(萘乙酸)、TDZ(噻苯隆)和S-3307(烯效唑)開展正交試驗(yàn)，尋找原球莖誘導(dǎo)、增殖、分化與生根的最佳培養(yǎng)基及影響原球莖增殖與分化的主要因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在最適激素配比下原球莖的誘導(dǎo)率達(dá)93.3%，原球莖增殖的系數(shù)達(dá)9.4，芽分化率達(dá)91.7%，最適培養(yǎng)基為MS+0.4 mg·L-1TDZ+0.2 mg·L-1NAA。并且，S-3307是影響金線蓮原球莖增殖的主要因子，TDZ是影響原球莖芽分化的關(guān)鍵因子。

研究表明，在相同的培養(yǎng)條件下，不同產(chǎn)地金線蓮之間誘導(dǎo)原球莖的結(jié)果差異較明顯[25]，誘導(dǎo)容易程度以廣西金線蓮最易，臺(tái)灣金線蓮最難(表2)；此外，同種金線蓮的不同外植體誘導(dǎo)原球莖效果同樣差異顯著(P<0.01)，以莖段作為外植體誘導(dǎo)原球莖，誘導(dǎo)率只有66%，而以成熟種子作為外植體誘導(dǎo)原球莖效果最佳，在90%以上。雖然以種子作為外植體誘導(dǎo)原球莖最易而且產(chǎn)量較多，但以它誘導(dǎo)的原球莖成苗率只有51%[32]。

表2 不同產(chǎn)地金線蓮在相同激素濃度下的原球莖和芽的誘導(dǎo)率Table 2 Protocorm and shoot induction rate Anoectochilus roxburghii plants of different origins

2.2 帶節(jié)莖段誘導(dǎo)叢生芽

對金線蓮組織培養(yǎng)與快繁研究表明，與莖片、頂芽作為外植體相比，以金線蓮帶節(jié)莖段為外植體誘導(dǎo)叢生芽效果最佳[13,33]，且以莖段為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽的增殖能力明顯優(yōu)于頂芽產(chǎn)生的叢生芽[17]。

對于帶節(jié)莖段誘導(dǎo)叢生芽增殖這一途徑，劉潤東等[34]在添加6-BA 1.0 mg·L-1的MS培養(yǎng)基上，附加低濃度的玉米素(ZT)能明顯促進(jìn)叢生芽的產(chǎn)生。郝麗麗等[35]也認(rèn)為適量濃度的ZT能顯著(P<0.05)促進(jìn)腋芽的發(fā)生與增殖，當(dāng)添加的玉米素濃度達(dá)到0.6 mg·L-1時(shí)最有利于芽的增殖。目前對于金線蓮帶節(jié)莖段誘導(dǎo)叢生芽這一途徑中6-BA與NAA的作用積極與否尚存爭議，但大多傾向于6-BA/NAA在6～10倍范圍內(nèi)與有機(jī)物配合使用能有效促進(jìn)腋芽的誘導(dǎo)與增殖[27,34-38](表3)。李艷冬等[27]發(fā)現(xiàn)，6-BA和NAA與有機(jī)物香蕉泥搭配使用時(shí)可以有效促進(jìn)腋芽的誘導(dǎo)與增殖。羅曉青等[28]研究發(fā)現(xiàn)，6-BA和ZT激素對叢生芽增殖的效果優(yōu)于KT，增殖系數(shù)達(dá)4.3。

2.3 通過愈傷組織分化成芽

外植體和激素配比同時(shí)作用于金線蓮愈傷組織分化過程[16,39]。馮亦平等[16]以金線蓮葉和莖片作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果表明，莖片誘導(dǎo)效果遠(yuǎn)好于葉片，并且以MS為基本培養(yǎng)基可形成大量叢生芽，在合適激素配比下誘導(dǎo)率可在60%以上，而以葉片誘導(dǎo)愈傷組織不僅時(shí)間長而且誘導(dǎo)率低。也有研究[39]同樣證實(shí)，以葉片作為外植體幾乎不能誘導(dǎo)出愈傷組織，相反莖段和莖片誘導(dǎo)的愈傷組織均能長出大量的不定芽。這表明金線蓮葉片難以誘導(dǎo)出愈傷組織，并不適合大規(guī)模應(yīng)用。

研究發(fā)現(xiàn)，6-BA較2,4-D、NAA、KT對金線蓮以莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織有明顯效果，影響強(qiáng)弱順序?yàn)?-BA>2,4-D>NAA>KT，各激素最佳濃度依次為1.0、2.0、0.5和0.25 mg·L-1，特別是在3.0 mg·L-12,4-D、1.0 mg·L-16-BA、0.5 mg·L-1NAA和 0.25 mg·L-1KT 的激素配比條件下效果最佳[40]。王雅英等[39]采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，6-BA和ZT是誘導(dǎo)金線蓮愈傷組織的主要因素，附加適量的KT可明顯提高愈傷組織的誘導(dǎo)率，其中，以不定芽作為外植體時(shí)，在2.0 mg·L-16-BA、0.5 mg·L-1NAA 和0.2 mg·L-1KT的激素配比條件下的愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)95%。以上研究均表明，6-BA在金線蓮愈傷組織誘導(dǎo)過程中起關(guān)鍵性作用。

表3 金線蓮叢生芽增殖培養(yǎng)基Table 3 Anoectochilus roxburghii bud proliferation medium

研究[30]表明，一定濃度的6-BA和NAA能促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)成芽，且當(dāng)6-BA和NAA濃度比例大于1時(shí)效果最為明顯。在6-BA和NAA濃度比例大于1的基礎(chǔ)上，添加適量的KT能夠更好地促進(jìn)芽的誘導(dǎo)，進(jìn)而產(chǎn)生叢生芽或原球莖[7]。

2.4 金線蓮生根

植物生根受多種因素影響，如激素比例、外源有機(jī)物種類與含量等[22]。取莖段粗壯、長勢好的金線蓮幼芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根時(shí)發(fā)現(xiàn)，在激素配比為0.5 mg·L-1NAA、4.0 mg·L-1IBA和0.1 mg·L-16-BA、并附加3 g·L-1活性碳和100 g·L-1香蕉汁的條件下，金線蓮的生根率可達(dá)97%；雖然添加6-BA對生根時(shí)間、生根率及根長有較大的促進(jìn)作用，但對生根數(shù)量影響不大[17]。在NAA使用方面，對福建金線蓮的研究中，在培養(yǎng)基中加入3 g·L-1的NAA有利于生根[41]，但同樣認(rèn)為對于金線蓮生根數(shù)沒有顯著(P>0.05)影響[42]。此外，添加活性炭有助于根的生長，其中活性炭濃度1 g·L-1時(shí)促進(jìn)作用效果最好，可在保證生根所需營養(yǎng)的同時(shí)，獲得較好的生根率并能提高根的質(zhì)量，有利于組培苗移栽[43]。

3 影響金線蓮組織培養(yǎng)的其他重要因素

3.1 光照條件的影響

目前關(guān)于金線蓮組織培養(yǎng)的研究主要集中于培養(yǎng)基配方調(diào)整上，在金線蓮培養(yǎng)與外部環(huán)境相關(guān)性方面的研究較少。金線蓮屬陰生植物，適合在蔭蔽環(huán)境下生長[44]，因此光照條件是控制其生長發(fā)育以及組織培養(yǎng)及人工栽培成功與否的關(guān)鍵環(huán)境因素[45-46]。

在蘭科植物組織培養(yǎng)早期愈傷誘導(dǎo)過程中，光照強(qiáng)度過大會(huì)催化酚類物質(zhì)氧化形成醌，導(dǎo)致褐化[47-48]。金線蓮組培苗的生長發(fā)育對環(huán)境光照強(qiáng)度同樣非常敏感，在較高或較低光照強(qiáng)度下，植株株高、節(jié)間長度、葉面積及干鮮重等均會(huì)受到影響[46,49]。對金線蓮組培苗生長過程中光強(qiáng)對其產(chǎn)生的影響研究結(jié)果表明，光強(qiáng)高時(shí)不利于其植株生長發(fā)育[50]。

此外，光質(zhì)對于蘭科植物蘭花的愈傷組織誘導(dǎo)同樣有明顯的影響，紅光/藍(lán)光比例在一定范圍內(nèi)，值越大對愈傷組織的誘導(dǎo)效果越好，并在比例為3∶1時(shí)能促進(jìn)愈傷組織生長[51]。但Tanaka等[52]認(rèn)為，藍(lán)光能促進(jìn)蘭科植物原球莖的發(fā)生。相關(guān)研究也表明，光質(zhì)對于金線蓮組培苗生長發(fā)育有重要影響[53-55]。在LED光質(zhì)對金線蓮組培苗生長發(fā)育、生理變化的影響研究中，分別釆用紅、黃、藍(lán)3種LED光對福建產(chǎn)金線蓮組培苗生長形態(tài)指標(biāo)以及葉綠素含量、氣孔發(fā)育的影響進(jìn)行比對，試驗(yàn)結(jié)果顯示，紅光與黃光處理有利于金線蓮組培苗株高增長，但兩個(gè)處理的植株較為纖細(xì)，且植株的葉綠素a和葉綠素b含量較低；藍(lán)光處理下金線蓮組培苗生長情況優(yōu)于其他兩種光處理，葉綠素含量較高，且葉面積與對照組相比增長明顯[56]。光質(zhì)雖然能對植物生長產(chǎn)生一定作用，但并不能取代激素對植物的影響，兩者更多是一種補(bǔ)償。

3.2 天然有機(jī)物的應(yīng)用

在蘭科植物離體培養(yǎng)中常用的有機(jī)物有香蕉泥、土豆泥、椰子汁等[57-58]。它們含有豐富的有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)和生理活性物質(zhì)，如氨基酸、酶和激素等[59]。這些物質(zhì)對于植物發(fā)育不是必需的，但對于植物組織培養(yǎng)和再生期間細(xì)胞和組織的增殖與分化具有明顯的促進(jìn)作用[60]。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加適量的土豆泥有利于金線蓮組培苗高度和莖直徑的增長[61](；添加適量的香蕉泥、椰子汁和蛋白胨有利于金線蓮組培苗莖和根系的生長，且香蕉泥會(huì)提高金線蓮增殖倍數(shù)[5](表4)。李艷冬等[27]研究同樣表明，在培養(yǎng)機(jī)中添加20%的香蕉泥和椰子汁能顯著促進(jìn)金線蓮組培幼苗生長(P<0.01)。然而，繼代增殖培養(yǎng)基中若加入香蕉泥，則接入的莖段很容易爛掉；而在生根培養(yǎng)基中附加適量的香蕉泥，長出的植株則葉子較綠、莖部較粗壯、長勢也較好[62](表4)。因此，在金線蓮離體培養(yǎng)中可以添加適量的天然有機(jī)物，促進(jìn)植株生長。但需要注意加入天然有機(jī)物質(zhì)的時(shí)間，不同階段加入有機(jī)物的效果不同。

表4 促進(jìn)金線蓮組培苗生長的因素Table 4 Factors to promote the growth of the tissue culture seedlings of Anoectochilus roxburghii

4 小結(jié)

金線蓮自然繁殖效率低并且生長緩慢，因此隨著對其需求的日益增大，急需建立高效的金線蓮組織培養(yǎng)體系。金線蓮作為蘭科開唇蘭屬植物，雖然目前能從其莖段、類原球莖等途徑誘導(dǎo)愈傷組織，但花費(fèi)時(shí)間長且誘導(dǎo)成功率低，因此目前金線蓮組培主要通過原球莖誘導(dǎo)途徑和具結(jié)莖段誘導(dǎo)叢生芽途徑實(shí)現(xiàn)，其中原球莖途徑增殖速度快、增殖系數(shù)高，是工廠化育苗的主要途徑。細(xì)胞分裂素和生長素是影響金線蓮?fù)庵搀w分化的關(guān)鍵因素，其中6-BA和NAA濃度比例在6～10范圍內(nèi)有利于外植體的分化，且TDZ對于金線蓮原球莖的誘導(dǎo)作用大于NAA。這與一些研究結(jié)果相同，未分化愈傷組織內(nèi)源生長素低于已分化出芽的愈傷組織[63]，內(nèi)源生長素含量升高時(shí)，其愈傷組織分化率降低，恰好與內(nèi)源細(xì)胞分裂素相反[64-65]。這表明，植物內(nèi)源激素含量調(diào)控細(xì)胞分化和生長的方向與進(jìn)程，外源激素通過與內(nèi)源激素平衡調(diào)節(jié)發(fā)揮作用。因此，植物愈傷組織分化是內(nèi)源與外源激素調(diào)節(jié)下的生長素降低和細(xì)胞分裂素升高的結(jié)果。金線蓮組培過程中加入有機(jī)物不僅對外植體的分化和芽的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用，并且有利于組培苗的生根，但長時(shí)間加入香蕉泥等有機(jī)物則會(huì)導(dǎo)致植物爛根，這與有機(jī)物中的活性氧(ROS)消除相關(guān)酶有關(guān)，相關(guān)研究表明，愈傷組織分化以及不定根的誘導(dǎo)都與過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)等活性氧消除相關(guān)酶有關(guān)[66]。并且在植物愈傷組織分化過程中POD、CAT、SOD等ROS消除酶活性逐漸增強(qiáng)[67-69]?；钚匝踉诩?xì)胞發(fā)育過程中可以穿透細(xì)胞膜，對細(xì)胞造成損害[70]，不同植物細(xì)胞在分化過程中對活性氧抗性強(qiáng)弱不同，加入外源ROS消除相關(guān)酶能減少對細(xì)胞的損害[71]。但過量的有機(jī)物則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞缺氧，因此金線蓮組培過程中應(yīng)適時(shí)適量添加有機(jī)物。此外，光照強(qiáng)度和光質(zhì)對金線蓮組培亦有顯著影響，其中紅光光強(qiáng)在一定范圍內(nèi)與愈傷組織生長呈正比，與原球莖發(fā)生呈反比，這可能與光誘導(dǎo)植物形態(tài)建成有關(guān)。上述研究對解決野生金線蓮資源緊缺和該物種的種質(zhì)資源保護(hù)具有積極意義。

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