某院結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥基因特征

劉厚明，陳 珊，黃莎莎，單萬(wàn)水

(1 深圳市第三人民醫(yī)院，廣東 深圳 518112；2廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524002)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染引起的一種對(duì)人類健康危害嚴(yán)重的慢性傳染病。2015年全球新增結(jié)核病例1 040萬(wàn)，新增耐多藥結(jié)核病例48萬(wàn)，超半數(shù)來(lái)自印度、中國(guó)和俄羅斯[1]。結(jié)核病是2016年傳染性疾病中排名第一的死亡原因[2]。我國(guó)現(xiàn)有427萬(wàn)活動(dòng)性肺結(jié)核患者，是全球30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，新發(fā)結(jié)核病病例位居全球第三，新增耐多藥結(jié)核患者數(shù)居全球第二[3]。耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)是指結(jié)核病患者感染的MTB至少同時(shí)對(duì)利福平(rifampicin, RFP)和異煙肼(isoniazid, INH)產(chǎn)生耐藥性[4]。2015年我國(guó)每10位結(jié)核病患者中僅有3位得到準(zhǔn)確診斷，每100位MDR-TB患者僅有5位獲得有效治療[5]。目前，快速檢測(cè)MTB耐藥相關(guān)基因的方法在全球范圍內(nèi)日益增多，國(guó)內(nèi)各地區(qū)積極開展研究地區(qū)耐藥基因突變特征，以期獲得快速分子檢測(cè)信息。本研究通過(guò)基因測(cè)序法分析結(jié)核分枝桿菌RFP耐藥相關(guān)基因rpoB和INH耐藥相關(guān)基因katG、inhA啟動(dòng)子的突變情況，探討某院耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株ropB、katG 和inhA 基因突變特征及其與耐藥性的相互關(guān)系，為新興MDR-TB分子診斷技術(shù)在本地區(qū)的應(yīng)用提供理論支撐，也為該院制定耐藥結(jié)核病防治規(guī)劃提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2012年8月—2014年5月某市傳染病?？漆t(yī)院住院患者送檢痰標(biāo)本分離培養(yǎng)的MTB 83株，菌株來(lái)源包括新發(fā)和復(fù)發(fā)患者，年齡為15～77歲；男性56例，女性27例。所有MTB DNA標(biāo)本均保存于-70℃冰箱并統(tǒng)一進(jìn)行相關(guān)耐藥基因突變位點(diǎn)檢測(cè)。

1.2 研究方法

1.2.1 菌株分離鑒定及藥敏試驗(yàn) 嚴(yán)格按照國(guó)家結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程進(jìn)行試驗(yàn)，標(biāo)本用BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀培養(yǎng)，培養(yǎng)陽(yáng)性的菌株進(jìn)行抗酸染色，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行菌種鑒定。采用世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的比例法對(duì)RFP、INH、鏈霉素和乙胺丁醇進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，4種藥物在培養(yǎng)基中的臨界濃度分別為1、0.1、1和5 mg/L，根據(jù)待測(cè)管與空白對(duì)照管中分枝桿菌的生長(zhǎng)情況對(duì)比判斷該藥的敏感性，結(jié)果判讀為耐藥(R)或敏感(S)。

1.2.2 細(xì)菌DNA的制備 吸取一定量的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的MTB，在80℃恒溫箱中滅活60 min，使用 Qiagen公司的細(xì)菌基因提取試劑盒提取基因組DNA，操作按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 通過(guò)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/的genebank獲得標(biāo)準(zhǔn)株H37RvrpoB、katG和inhA基因全序列，采用primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.2.4 目的基因的擴(kuò)增與測(cè)序 PCR反應(yīng)體積為50 μL，包括3 μL模板，5 μL 10× LA PCR Buffer II，2.5 μL引物，8 μL dNTP混合液，0.5 μL Taq PCR master mix，31 μL去離子水。擴(kuò)增條件： 94℃變性1 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃210 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行純化和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv序列比對(duì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥敏結(jié)果 收集的83株MTB臨床樣本中，耐藥株60株，全敏感株23株。其中RFP耐藥株39株，敏感株44株；INH耐藥株51株，敏感株32株；對(duì)RFP及INH同時(shí)耐藥30株。

2.2 RFP耐藥相關(guān)基因rpoB的突變特征 39株RFP耐藥株中有38株檢測(cè)到rpoB基因突變，突變率達(dá)97.44%(38/39)，其中36株在rpoB基因81bp的基因核心區(qū)域內(nèi)發(fā)生突變，2株在1 156位點(diǎn)發(fā)生突變。測(cè)序結(jié)果顯示，39株RFP耐藥株中共發(fā)現(xiàn)19種突變形式，其中9種為本研究新發(fā)現(xiàn)的突變類型，主要包括兩個(gè)以上密碼子聯(lián)合突變、點(diǎn)突變、同一密碼子雙重突變，未發(fā)現(xiàn)堿基插入或缺失。突變菌株中單位點(diǎn)突變有6株(15.79%)，多位點(diǎn)聯(lián)合突變有32株(84.21%)。最常見的突變位點(diǎn)為531位點(diǎn)，突變率達(dá)60.53%(23/38)，變化形式主要由組氨酸(His)突變?yōu)榱涟彼?Leu)或酪氨酸(Tyr)；其次的突變位點(diǎn)為526位點(diǎn)，突變率為23.68%(9/38)。44株RFP敏感菌株中有31株檢測(cè)到突變，其中1 156位點(diǎn)同義突變占80.65%(25/31)。見表2。

表2 83株MTB RFP耐藥相關(guān)基因rpoB突變特征

注：NMa為無(wú)基因突變；b為TBDReaMDB結(jié)核分枝桿菌數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.tbdreamdb.com)中未報(bào)道位點(diǎn)；c為氨基酸同義突變，該位點(diǎn)在TBDReaMDB結(jié)核分枝桿菌數(shù)據(jù)庫(kù)中未見報(bào)道；突變前后改變氨基酸使用一字碼簡(jiǎn)寫；TBDReaMDB結(jié)核分枝桿菌數(shù)據(jù)庫(kù)查詢?nèi)掌跒?017年7月25日

2.3 INH耐藥相關(guān)基因katG、inhA的突變特征 98.04%(50/51)的INH耐藥株在katG基因出現(xiàn)突變，其中14株為單位點(diǎn)突變，36株存在多位點(diǎn)聯(lián)合突變。14株單位點(diǎn)突變菌株中，有8株為katG 315位點(diǎn)突變；36株多位點(diǎn)聯(lián)合突變菌株中，有27株為katG 315位點(diǎn)突變；katG 315位點(diǎn)突變率為70.00%(35/50)。32株INH敏感菌株中未發(fā)現(xiàn)katG 315位點(diǎn)突變。katG 463位密碼子在耐藥株和敏感株中均檢測(cè)到突變，突變率分別為74.51%(38/51)、59.38%(19/32)，兩者突變率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.09，P=0.15)。51株INH耐藥株中僅1株檢測(cè)到inhA 21位點(diǎn)突變，且為inhA 21位點(diǎn)與katG 463位點(diǎn)聯(lián)合突變，其余50株分離株inhA 21位點(diǎn)基因序列與標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv序列均一致；INH敏感株未檢測(cè)到inhA 21位點(diǎn)基因突變。見表3。

表3 83株MTB分離株katG、inhA基因突變情況

*：為inhA基因上的密碼子；NMa為無(wú)基因突變；b為TBDReaMDB結(jié)核分枝桿菌數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.tbdreamdb.com)中未報(bào)道位點(diǎn)；c為氨基酸同義突變，該位點(diǎn)在TBDReaMDB結(jié)核分枝桿菌數(shù)據(jù)庫(kù)中未見報(bào)道；突變前后改變氨基酸使用一字碼簡(jiǎn)寫；TBDReaMDB結(jié)核分枝桿菌數(shù)據(jù)庫(kù)查詢?nèi)掌跒?017年7月25日

3 討論

21世紀(jì)以來(lái)，隨著耐藥MTB的出現(xiàn)和傳播，全球結(jié)核病疫情呈現(xiàn)死灰復(fù)燃的態(tài)勢(shì)，耐藥結(jié)核病患者尤其是耐多藥及廣泛耐藥性結(jié)核病患者逐年增加，給公共衛(wèi)生安全帶來(lái)嚴(yán)重威脅。INH和RFP作為目前使用最廣泛的一線抗結(jié)核藥物，在MTB耐藥譜中高居前2位[6]，而INH和RFP較高耐藥率的出現(xiàn)，主要與其耐藥基因突變相關(guān)[7]。全國(guó)各地區(qū)關(guān)于MTB耐RFP和INH相關(guān)基因的突變頻率存在差異，因此，以地區(qū)為單位研究MTB耐藥基因的突變特征對(duì)各地區(qū)開展結(jié)核病防治工作有重大意義。

rpoB是MTB RNA聚合酶β亞單位的編碼基因，長(zhǎng)約3 534 bp，編碼1 178個(gè)氨基酸。大量研究[8-9]表明，90%～97%耐RFP的MTB是由rpoB基因內(nèi)的RFP耐藥基因核心區(qū)(rifampicin resistance determining region，RRDR)發(fā)生突變引起。本研究結(jié)果顯示，83株MTB中有39株出現(xiàn)RFP耐藥，RFP耐藥率為46.99%，耐RFP菌株中檢測(cè)到rpoB基因RRDR區(qū)域內(nèi)突變36株，突變率達(dá)92.31%(36/39)。本研究中不計(jì)入同義突變類型，最常見的突變位點(diǎn)是531、526位點(diǎn)，突變頻率分別為60.53%(23/38)和23.68%(9/38)，兩位點(diǎn)突變頻率之和占84.21%(32/38)；其中531位點(diǎn)突變頻率高于湖南報(bào)道的51.1%[10]和江蘇報(bào)道的55.4%[11]，低于新疆地區(qū)報(bào)道的73.6%[12]，說(shuō)明地區(qū)間rpoB 531突變頻率存在一定差異。此外，發(fā)現(xiàn)有3株菌在RRDR區(qū)內(nèi)出現(xiàn)雙堿基突變，以rpoB 511和516位點(diǎn)、rpoB 516和526位點(diǎn)以及rpoB 526和533位點(diǎn)聯(lián)合突變的形式存在，考慮可能rpoB 511、516和533位點(diǎn)突變與RFP低濃度耐藥有關(guān)[13]。RRDR區(qū)域外發(fā)現(xiàn)2個(gè)同義突變位點(diǎn)D382D和A1156A，可能與RFP耐藥無(wú)關(guān)[14]。本研究還檢測(cè)到10個(gè)未被TBDReaMDB結(jié)核分枝桿菌數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的E162G、T240P、G317D等位點(diǎn)，這些位點(diǎn)以與RRDR區(qū)的rpoB 531、526、516、511等位點(diǎn)聯(lián)合突變的形式存在，分析這種聯(lián)合突變類型中RRDR區(qū)的突變位點(diǎn)可能對(duì)MTB耐RFP起主導(dǎo)作用，區(qū)域外與之聯(lián)合突變的位點(diǎn)與RFP耐藥的相關(guān)性并不明確，也許有協(xié)同作用，也可能與RFP耐藥無(wú)關(guān)，尚待日后研究。本研究中發(fā)現(xiàn)MTB耐RFP以rpoB 531位點(diǎn)突變?yōu)橹?，其次?26位點(diǎn)，與2012年廣東地區(qū)報(bào)道[15]rpoB基因突變特征相似，說(shuō)明檢測(cè)此兩位點(diǎn)存在突變與否可以作為該地區(qū)MTB對(duì)RFP耐藥性的分子診斷依據(jù)。

INH是前體藥物，通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)增進(jìn)入MTB菌體內(nèi)，能抑制細(xì)胞壁分枝菌酸的合成，從而破壞其完整性以達(dá)到殺菌目的。INH耐藥機(jī)制復(fù)雜，涉及katG酶、烯酰脂酰載體蛋白還原酶(inhA)、β-酮?；\(yùn)載蛋白合成酶(kasA)、烷基過(guò)氧化氫還原酶(ahpC)和還原型輔酶I脫氫酶(ndh)等基因。據(jù)研究報(bào)道， 85%以上INH耐藥株存在katG基因和inhA-15位點(diǎn)突變[16-18]。本研究中，83株MTB菌株有51株耐INH，耐藥率為61.45%，檢測(cè)到katG基因序列突變?yōu)?0株，突變率為98.04%(50/51)，僅1株檢測(cè)到inhA突變，表明katG基因突變與INH耐藥相關(guān)。本次測(cè)序結(jié)果顯示，katG 315位點(diǎn)突變率為70.00%(35/50)，且存在katG 315突變的均為INH耐藥株，說(shuō)明在該院可將katG 315突變作為快速檢測(cè)MTB對(duì)INH耐藥性的一個(gè)可靠標(biāo)志。同時(shí)，INH耐藥株中還檢測(cè)到katG基因P100T、V196I、W191G 等8個(gè)未被TBDReaMDB結(jié)核菌數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的突變位點(diǎn)，除多態(tài)性位點(diǎn)、同義突變和聯(lián)合突變，W191G、A264V、P325S、Y608D、G490D、N508D位點(diǎn)均屬單堿基有效突變，以上位點(diǎn)可能與INH耐藥相關(guān)，但需更多數(shù)據(jù)和相關(guān)研究證實(shí)。

inhA 基因最常見的突變位點(diǎn)是inhA-15和inhA-8位點(diǎn)，inhA 啟動(dòng)子突變被證實(shí)與INH 低濃度耐藥相關(guān)[19]。本實(shí)驗(yàn)中僅1株出現(xiàn)inhA基因突變，占突變株的2.00%(1/50)，低于Zhou等[20]的研究結(jié)果，與Tseng等[21]的研究結(jié)果相似，由此推測(cè)耐藥株中inhA基因突變具有地域差異性，在該院inhA基因的突變頻率偏低，但也不排除是因樣本量較少所致。除此之外，本實(shí)驗(yàn)在INH耐藥株和敏感株中均檢測(cè)到katG 463(CGG-CTG)突變，據(jù)報(bào)道katG463突變是自然存在的基因多態(tài)性位點(diǎn)，與INH耐藥性無(wú)關(guān)[22]。

本實(shí)驗(yàn)采用BD MGIT 960 RISE比例法和DNA測(cè)序法對(duì)本院耐RFP和INH的MTB相關(guān)基因的突變情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)30株耐多藥菌株均發(fā)生rpoB和katG基因聯(lián)合突變，說(shuō)明rpoB和katG基因存在協(xié)同作用，同時(shí)發(fā)生突變可導(dǎo)致MTB對(duì)RFP和INH產(chǎn)生耐藥，且有報(bào)道[23]指出90%～95%耐RFP的MTB菌株同時(shí)耐INH，單獨(dú)對(duì)MTB進(jìn)行RFP耐藥性分析可初步鑒定MDR-TB 。另外，61株耐藥株中仍有2株未檢測(cè)到相關(guān)基因突變，提示這些菌株的突變點(diǎn)可能出現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的相關(guān)基因區(qū)域外，或是由其他耐藥機(jī)制引起，比如異源性耐藥等。一些MTB耐藥基因突變位點(diǎn)與表型耐藥之間的關(guān)系并不十分明確，仍需繼續(xù)研究以提高基因檢測(cè)的特異性和靈敏度。

總之，MTB耐藥基因突變情況存在地域差異，可能受樣本量大小和抽樣方式、人群遺傳背景、菌株進(jìn)化背景以及環(huán)境等因素影響。醫(yī)院可通過(guò)篩檢rpoB基因的RRDR區(qū)域、katG基因高頻突變點(diǎn)作為初步快速判斷耐多藥MTB耐藥性的方法之一。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2017[R]. Geneva, WHO, 2017.

[2] World Health Organization. Global tuberculosis report 2016[R]. Geneva, WHO, 2016.

[3] 中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院辦公廳.“十三五”全國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃[J]. 中國(guó)實(shí)用鄉(xiāng)村醫(yī)生雜志, 2017, 24(5):1-5.

[4] Zhao LL, Chen Y, Liu HC, et al. Molecular characterization of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from China[J]. Antimicrobial Agents Chemother, 2015, 58(4): 1997-2005.

[5] World Health Organization. Global tuberculosis report 2015[R]. Geneva, WHO, 2015.

[6] Yakrus MA, Driscoll J, Lentz AJ. Concordance between molecular and phenotypic testing ofMycobacteriumtuberculosiscomplex isolates for resistance to rifampin and isoniazid in the United States[J]. J Clin Microbiol, 2014, 52(6): 1932-1937.

[7] Kalokhe AS, Shafiq M, Lee JC, et al. Multidrug-resistant tuberculosis drug susceptibility and molecular diagnostic testing[J]. Am J Med Sci, 2013, 345(2): 143-148.

[8] Ullah I, Shah AA, Basit A, et al. Rifampicin resistance mutations in the 81bp RRDR ofrpoB gene inMycobateriumtuberculosisclinical isolates using Xpert MTB/RIF in Khyber Pakhtunkhwa, Pakistan: a retrospective study[J]. BMC Infect Dis, 2016, 16(1): 413.

[9] Chen Y, Zhao B, Liu HC, et al. Prevalence of mutations conferring resistance among multi- and extensively drug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates in China[J]. J Antibiot(Tokyo), 2016, 69(3): 149-152.

[10] 周志紅, 王華洪. rpoB基因突變與結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥相關(guān)性研究[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2013, 20(10):1189-1191.

[11] 張海晴, 黃海濱, 劉成永,等. 徐州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌基因分型及其與利福平耐藥基因突變的關(guān)系[J]. 2017, 38(2):223-224,228.

[12] 楊建東, 陳陽(yáng)貴, 馬麗, 等. 烏魯木齊市耐多藥結(jié)核分枝桿菌基因突變特征分析[J]. 中華疾病控制雜志，2017, 21(1):22-25.

[13] Tekwu EM, Sidze LK, Assam JP, et al. Sequence analysis for detection of drug resistance inMycobacteriumtuberculosiscomplex isolates from the Central Region of Cameroon[J]. BMC Microbiol, 2014, 14: 113.

[14] 廖小琴, 劉梅, 彭章麗, 等. 耐利福平結(jié)核分枝桿菌rpoA、rpoB、rpoC和rpoZ 突變的研究[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志(電子版), 2013, 7(22):38-40.

[15] 許蘊(yùn)怡, 譚耀駒, 曾少芳, 等. 廣東地區(qū)臨床分離結(jié)核分枝桿菌katG、rpoB、rpsL耐藥基因變異研究[J]. 中國(guó)處方藥, 2012, 10(3):41-44.

[16] Jagielski T, Grzeszczuk M, Kamiński M, et al. Identification and analysis of mutations in thekatG gene in multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisclinical isolates[J]. Pneumonol Alergol Pol, 2013, 81(4): 298-307.

[17] Chen XY, Kong F, Wang Q, et al. Rapid detection of isoniazid, rifampin and ofloxacin resistance inMycobacteriumtuberculosisclinical isolates using high resolution melting analysis[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(10): 3450-3457.

[18] Wang F, Shen H, Guan M, et al. High-resolution melting facilitates mutation screening ofrpsL gene associated with streptomycin resistance inMycobacteriumtuberculosis[J]. Microbiol Res, 2011, 166(2): 121-128.

[19] Abe C, Kobayashi I, Mitarai S, et al. Biological and molecular characteristics ofMycobacteriumtuberculosisclinical isolates with low level resistance to isoniazid in Japan[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(7): 2263-2268.

[20] Zhou A, Nawaz M, Duan Y, et al. Molecular characterization of isoniazid-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from Xi’an, China[J]. Microb Drug Resist, 2011, 17(2): 275-281.

[21] Tseng ST, Tai CH, Li CR, et al. The mutations ofkatG andinhA genes of isoniazid-resistantMycobacteriumtuberculosisin Taiwan[J]. J Microbiol Immunol Infect, 2015, 48(3): 249-255.

[22] Herrera L, Valcerde A, Saiz P, et al. Molecular characterization of isoniazid-resistantMycobacteriumtuberculosisclinical strains isolated in the Philippines[J]. Int J Antimicrob Agents, 2004, 23(6): 572-576.

[23] Chia BS, Lanzas F, Rifat D, et al. Use of multiplex allele-specific polymerase chain reaction (MAS-PCR) to detect multidrug-resistant tuberculosis in Panama[J]. PloS One, 2012, 7(7): e40456.