廣東火龍果果柄腐爛病病原菌的分離及鑒定

雷夢(mèng)英，楊曉朱，李落葉，匡蓉琳，李馥純，莫介羽，黃少彬

（廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520）

火龍果屬仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus）植物，原產(chǎn)于墨西哥、巴西、古巴、尼加拉瓜等中美洲的熱帶雨林和沙漠地區(qū)，后經(jīng)人工栽培遍及美國(guó)南部以及越南、菲律賓、泰國(guó)等東南亞國(guó)家，在我國(guó)海南、廣東、廣西、貴州、福建、云南和臺(tái)灣地區(qū)也有種植［1-4］。火龍果是熱帶水果中少有的涼性水果，富含水溶性膳食纖維、花青素、維生素等，具有抗癌和預(yù)防高血壓的功效［5-6］。

火龍果高產(chǎn)、早產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，是近年來(lái)新興的熱帶水果之一。目前國(guó)內(nèi)火龍果的主要栽培品種為紅皮紅肉和紅皮白肉兩種類型，而種植紅肉品種的經(jīng)濟(jì)效益最佳［7-8］。隨著火龍果種植面積不斷擴(kuò)大，其病害發(fā)生也逐漸加重。據(jù)報(bào)道，火龍果莖干病害有瘡痂病、莖腐病、枯萎病、莖枯病、潰瘍病、枯斑病、基腐病和病毒病等［9-11］?；瘕埞麑?shí)病害主要有由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、單隔鐮刀菌（F.dimerum）、桃吉爾霉（Gilbertella persicaria）、仙人掌平臍蠕孢（Bipolaris cactivora）等引起的火龍果果實(shí)腐爛?。?2-14］，以及由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的炭疽病在火龍果的莖干和果實(shí)上均可發(fā)?。?5］。

我們?cè)趶V東省廣州市從化區(qū)一火龍果種植基地發(fā)現(xiàn)了一種火龍果新病害，命名為火龍果果柄腐爛病。病原菌通過(guò)危害火龍果果柄，影響其商品價(jià)值。火龍果果柄腐爛病的癥狀與已報(bào)道的火龍果病害癥狀存在明顯差異，目前尚未有對(duì)該病害病原菌系統(tǒng)研究的報(bào)道。鑒于此，我們對(duì)該病害的病原菌進(jìn)行了分離和純化培養(yǎng)，根據(jù)病原菌的菌落形態(tài)、分生孢子形態(tài)特征，同時(shí)結(jié)合rDNA-ITS序列和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析對(duì)該病原菌進(jìn)行鑒定分析，明確火龍果果柄腐爛病的病原菌種類，以期為該病的防治研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試紅肉火龍果于2017年7月20日購(gòu)自廣東省廣州市從化區(qū)溫泉鎮(zhèn)一火龍果種植基地，采摘后直接運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室，室溫存放，觀察發(fā)病情況。

馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15 g，水1000 mL；修改的Bilay培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1 g，硝酸鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，淀粉0.2 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖 0.2 g，瓊脂 15 g，水 1000 mL。

1.2 病原菌分離

在感染腐爛病的火龍果果柄病健交界處切取大小為2～3 mm×2～3 mm的組織塊。表面消毒后于70%酒精浸泡消毒1 min，無(wú)菌水沖洗1次。2%次氯酸鈉溶液浸泡消毒1 min，無(wú)菌水沖洗3次，將組織塊置于無(wú)菌吸水紙上晾干。將消毒處理的組織塊置于PDA固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中加入終濃度為50 μL/mL的硫酸鏈霉素以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。25℃光照和黑暗交替培養(yǎng)2 d后，用滅菌的接種針挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)入PDA平板培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.3 病原菌單孢分離純化

用滅菌水沖洗病原菌菌落，以兩層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾除去菌絲，配制成濃度為1.0×104個(gè)/mL的孢子懸浮液。取10 μL孢子懸浮液均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上。25℃光照和黑暗交替培養(yǎng)，待由單個(gè)孢子形成的菌落長(zhǎng)出后，挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)。純化的菌株接種在PDA試管斜面上，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病原菌的柯赫氏法則驗(yàn)證

將分離獲得的病原菌在PDA平板上25℃光照和黑暗交替培養(yǎng)7 d，制備孢子懸浮液，無(wú)菌水稀釋至1.0×106個(gè)/mL。將健康無(wú)傷口的火龍果在2%次氯酸鈉溶液浸泡3 min，蒸餾水沖洗3次后在超凈工作臺(tái)上晾干。將10 μL孢子懸浮液接種于火龍果果柄處，放入塑料盒中。接種等量無(wú)菌水作為空白對(duì)照。每個(gè)處理接種10個(gè)果實(shí)。取發(fā)病的火龍果，按照1.2的方法重新分離病原菌，并與原接種病原菌進(jìn)行菌落形態(tài)、顏色比較，如果重新分離獲得的病原菌與原接種病原菌一致即確定其為火龍果果柄腐爛病的病原菌。

1.5 病原菌形態(tài)觀察和鑒定

將保存的菌株接種到PDA平板上，25℃活化培養(yǎng)3 d。使用無(wú)菌手術(shù)刀在菌落邊緣切取菌絲塊（5 mm×5 mm），分別轉(zhuǎn)接到新的PDA平板和修改的Bilay培養(yǎng)基平板上，25℃光照和黑暗交替培養(yǎng)，記錄菌落的形態(tài)特征包括菌落顏色、大小等。無(wú)菌接種針挑取培養(yǎng)7 d的菌落，制備臨時(shí)玻片觀察病原菌顯微特征。依據(jù)菌落培養(yǎng)特征，以及分生孢子形態(tài)、顏色和大小等特征，參照布斯（Booth）鐮刀菌分類系統(tǒng)［16］對(duì)分離獲得的病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.6 病原真菌的分子生物學(xué)鑒定及分析

利用真菌通用引物擴(kuò)增病原菌基因組中的保守rDNA-ITS序列，為病原菌種類的鑒定提供分子依據(jù)。

基因組DNA提?。簩⒉≡杲臃N于PDA平板上，25℃光照和黑暗交替培養(yǎng)7 d。刮取約0.1 g菌絲體，于液氮中研磨成粉末。使用AxyPrep基因組DNA小量試劑盒提取基因組DNA。

rDNA-ITS序列擴(kuò)增及分析：以提取的病原菌菌株的基因組DNA為模板，使用真菌通用引物 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'），按以下條件擴(kuò)增其rDNA-ITS序列。50μL PCR擴(kuò)增體系如下：10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，10 μmol/L ITS4 和 ITS5引物各 1 μL，病原菌 DNA 2 μL，5 U/μL的ExTaqDNA聚合酶0.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s、56℃退火40 s、72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min；4℃保存。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳（110 V，30 min）檢測(cè)確認(rèn)目的片段大小后，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收純化?；厥占兓a(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。采用BLAST程序?qū)@得的測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源比對(duì)分析，對(duì)病原菌進(jìn)行分子水平鑒定。從NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)中下載病原菌rDNA-ITS序列的同源序列及其近緣種序列。用Clustal x 2.0軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)后，用Mega 7.0系統(tǒng)發(fā)育軟件采用鄰近法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。依據(jù)分支的支持率，確定其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀描述

火龍果果實(shí)室溫存放5 d后，其腐爛病發(fā)病最為嚴(yán)重。此外，還發(fā)現(xiàn)一種為害火龍果果柄的腐爛?。▓D1A，封三），命名為火龍果果柄腐爛病。該病發(fā)病率較低（5%左右），影響火龍果的外觀和商品價(jià)值。其典型癥狀為果柄處有白色菌絲。挑取白色菌絲顯微觀察，發(fā)現(xiàn)存在少量的鐮刀菌（Fusariumsp.）大型分生孢子，初步推斷該病原菌為一種鐮刀菌（Fusariumsp.）。

2.2 病原菌柯赫法則驗(yàn)證

火龍果果柄腐爛病病原菌經(jīng)單孢分離，共獲得純化菌株15株（A1～A15）。除菌株A5和A12外，其他13株的菌落形態(tài)完全一致，隨機(jī)選取菌株A11作為代表菌株用于后續(xù)研究。運(yùn)用柯赫法則分別將菌株A5、A11和A12接種于健康火龍果的果柄處，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株A5和A12接種7 d后，仍無(wú)明顯癥狀。而菌株A11接種3 d后火龍果果柄處可見(jiàn)明顯的白色菌絲，接種7 d后的癥狀與火龍果果柄腐爛病的癥狀相符合（圖1B、C，封三）。從接種火龍果的發(fā)病部位分離到與菌株A11菌落培養(yǎng)性狀、分生孢子形態(tài)一致的病原菌，符合柯赫氏法則。由此確定病變組織分離獲得的這種鐮刀菌是火龍果果柄腐爛病的致病病原菌。

2.3 病原菌培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征

病原菌菌株A11在PDA培養(yǎng)基上的菌落呈圓形，生長(zhǎng)旺盛，生長(zhǎng)速率為13.5 mm/d（圖2A）。氣生絮狀菌絲初期呈白色，后期產(chǎn)生橙黃色大孢子堆。培養(yǎng)基平板背面顏色初期為白色，后變?yōu)辄S褐色，最后變成深棕色。病原菌在修改的Bilay培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率為18.7 mm/d（圖2B），氣生菌絲少，白色。大型分生孢子從瓶狀小梗上產(chǎn)生，孢子量多。未觀察到小型分生孢子。大型分生孢子鐮刀狀，略微向內(nèi)彎曲，3～6個(gè)隔膜（多為3～5個(gè)，圖2C）。根據(jù)病原菌菌落形態(tài)和大型分生孢子特征，參照布斯（Booth）鐮刀菌分類系統(tǒng)［16］，初步鑒定火龍果果柄腐爛病原菌為木賊鐮刀菌（F. equiseti）。

2.4 病原菌rDNA-ITS分子鑒定

采用rDNA-ITS分子鑒定將分離獲得的病原菌鑒定到種。以分離獲得的病原菌菌株A11、A13和A15的基因組DNA為模板，使用真菌通用引物ITS4和ITS5擴(kuò)增獲得它們的rDNAITS序列（圖3）。測(cè)序結(jié)果表明病原菌菌株A11、A13和A15的rDNA-ITS序列完全一致，序列長(zhǎng)度約為540 bp。將病原菌菌株A11序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該病原菌菌株的rDNA-ITS序列與登錄號(hào)為HM008677的木賊鐮刀菌（F. equiseti）rDNA-ITS序列的同源性最高，為100%，比對(duì)覆蓋率（query cover）為99%，E值為0。綜合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果和rDNAITS序列比對(duì)結(jié)果，最終確認(rèn)引起火龍果果柄腐爛病的病原菌為木賊鐮刀菌。

圖2 火龍果果柄腐爛病原菌菌落特征和分生孢子形態(tài)

圖3 火龍果果柄腐爛病原菌rDNA-ITS序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.5 病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析

基于rDNA-ITS基因的堿基序列，以鏈格孢菌（Alternaria alternata）的rDNA-ITS序列（FJ618522.1）為外圍樹(shù)根，采用鄰接法（NJ）構(gòu)建了8株鐮刀菌屬的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4）。發(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬存在明顯的屬內(nèi)遺傳差異，其中引起火龍果果柄腐爛病的木賊鐮刀菌與梨孢鐮刀菌（F. poae）、禾谷鐮刀菌（F. graminearu）和擬枝孢鐮刀菌（F. sporotrichioides）的遺傳關(guān)系較近，其支持率高達(dá)99%。而木賊鐮刀菌與串珠鐮刀菌（F. proliferatum）和茄腐鐮孢菌（F.solani）的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié)論與討論

火龍果是近年發(fā)展起來(lái)的熱帶和亞熱帶水果之一，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能?；瘕埞弋a(chǎn)、早產(chǎn)，種植技術(shù)要求不高，市場(chǎng)需求大且價(jià)格好，具有十分可觀的發(fā)展前景［7］。但火龍果種植地區(qū)氣溫高，濕度大，隨著火龍果種植面積的不斷擴(kuò)大，病害問(wèn)題日益嚴(yán)重［9］。

鐮刀菌屬（Fusarium）又稱鐮孢菌屬，普遍存在于土壤和有機(jī)體內(nèi)，兼寄生或腐生生活。其中尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和單隔鐮刀菌（F. dimerum）均可引起火龍果果實(shí)腐爛病的發(fā)生［12］。鐮刀菌屬菌種資源繁多，形態(tài)特征復(fù)雜。本研究以傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特性鑒定為基礎(chǔ)，結(jié)合rDNA-ITS基因序列同源性分析，最終確定火龍果果柄腐爛病的病原菌為木賊鐮刀菌。已有研究表明木賊鐮刀菌作為弱致病菌，能侵染多種植物的種子、根系、塊莖和果實(shí)，引起剛竹稈褐腐病、黃蜀葵莖枯病、辣木枝枯病、櫻桃采后軟腐病等，感病植株枝葉枯黃脫落，枯萎死亡［17-20］。此外，木賊鐮刀菌也可與鐮刀菌屬等其他病原菌通過(guò)復(fù)合侵染，引起玉米穗腐病、苜蓿根腐病、向日葵枯萎病等［21-23］。

火龍果果柄腐爛病屬首次發(fā)現(xiàn)，盡管尚未發(fā)現(xiàn)其對(duì)火龍果可食部分造成危害，但對(duì)火龍果外觀品質(zhì)存在潛在的影響。對(duì)于火龍果果柄腐爛病，除了進(jìn)一步了解其發(fā)生特點(diǎn)和流行規(guī)律，還需要明確木賊鐮刀菌的生物學(xué)特性及其對(duì)殺菌劑的敏感性，為火龍果果柄腐爛病的綜合防治提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 田新民，李洪立，何云，等. 火龍果研究現(xiàn)狀［J］. 北方園藝，2015（18）：188-193.

［2］ 鄭良永，鐘寧．雷州半島火龍果高效栽培技術(shù)［J］．廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（3）：76-78.

［3］ 蘇明，任太軍，袁水清，等. 海南火龍果反季節(jié)生產(chǎn)技術(shù)初探［J］. 中國(guó)南方果樹(shù)，2018，47（1）：83-86

［4］ 黃艷芳，秦媛媛，阮曉靜，等. 廣西火龍果產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及可持續(xù)發(fā)展對(duì)策研究［J］. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，37（6）：97-99.

［5］ 羅萍，師莉莎，劉華忠. 火龍果汁體外抗氧化能力研究［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40（20）：93-96.

［6］ 宋燕. 火龍果果皮中可溶性膳食纖維的提?。跩］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39（12）：209-212.

［7］ 鄧仁菊，范建新，蔡永強(qiáng). 國(guó)內(nèi)外火龍果研究進(jìn)展及產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀［J］. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（6）：188-192.

［8］ 劉順枝，劉政浩，林潤(rùn)怡，等. 白肉火龍果染色體制片技術(shù)及核型分析［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，42（3）：115-118.

［9］ 袁誠(chéng)林，張偉鋒，袁紅旭. 粵西地區(qū)火龍果病害調(diào)查初報(bào)及防治措施［J］. 中國(guó)南方果樹(shù)，2004，33（2）：49-50.

［10］ 易潤(rùn)華，甘羅軍，晏冬華，等. 火龍果潰瘍病病原菌鑒定及生物學(xué)特性［J］. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2013，40（2）：102-108.

［11］ 戴俊，王會(huì)會(huì)，符碧海，等. 火龍果潰瘍病和莖腐病病原菌的生物學(xué)特性測(cè)定［J］. 中國(guó)南方果樹(shù)，2017，46（1）：78-82.

［12］ 崔志婧，王奕文，于岳，等. 上海市進(jìn)口火龍果軟腐病病害分析［J］. 微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（10）：1499-1506.

［13］ 劉月廉，周娟，趙志慧，等. 廣東省火龍果腐爛病病原鑒定［J］. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，30（5）：585-588.

［14］ 郭力維，吳毅歆，何漢興，等. 云南省火龍果采后果腐病研究［J］. 果樹(shù)學(xué)報(bào)，2014（1）：111-114.

［15］ Masyahit M，Sijam K，Awang Y，et al. The first report of the occurrence of anthracnose disease caused byColletotrichum gloeosporioides（Penz.）Penz. & Sacc. on dragon fruit（Hylocereusspp.）in Peninsular Malaysia［J］. American Journal of Applied Sciences，2009，6（5）：g6420-g6420.

［16］ 布斯（Booth）. 鐮刀菌屬［M］. 陳其煐，譯. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1988.

［17］ 周春來(lái)，吳小芹，葉利芹，等. 剛竹稈褐腐病病原形態(tài)及分子鑒定［J］. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，35（3）：84-88.

［18］ 夏敏媛，張瑜，沈小林，等. 黃蜀葵莖枯病病原菌的分離與鑒定［J］. 中國(guó)生化藥物雜志，2015，35（9）：12-14.

［19］ 康迅，靳鵬飛，馮霞，等. 辣木枝枯病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性［J］. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2017，44（3）：481-487.

［20］ Wang C，Wang Y. First report of postharvest fruit rot caused byFusarium equisetion storedCerasus pseudocerasusin China［J］. Plant Disease，2017，101（6）.

［21］ 黃思良，盧維宏，陶愛(ài)麗，等. 南陽(yáng)市玉米穗腐病致病鐮刀菌種群結(jié)構(gòu)分析［J］. 南陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2012（3）：54-57.

［22］ 魏然，郭慶元，白劍宇，等. 苜蓿根腐病多種病原菌的分子檢測(cè)［J］. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，53（7）：1268-1275.

［23］ 高婧，張園園，王凱，等. 向日葵枯萎病菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性［J］. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2016，38（2）：214-222.