草類植物微生物實(shí)驗(yàn)室的雜菌種類及其來(lái)源

胡進(jìn)玲，古麗君，曹 師，成鳳花，李彥忠，2

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草地畜牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

微生物實(shí)驗(yàn)室是指進(jìn)行微生物研究的場(chǎng)所，主要用以檢測(cè)、分離、培養(yǎng)、保存各類有致病性的真菌、細(xì)菌、病毒等微生物或植物內(nèi)生真菌、根瘤菌等有益微生物。微生物實(shí)驗(yàn)室要求無(wú)菌環(huán)境，除研究人員目標(biāo)菌種之外的其他真菌和細(xì)菌均統(tǒng)稱為雜菌。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的微生物一旦被雜菌污染，輕者需要重新培養(yǎng)，嚴(yán)重則延緩試驗(yàn)進(jìn)程，重者丟失寶貴的菌種，致使科研失敗[1-2]。

隨著國(guó)家和社會(huì)對(duì)科學(xué)研究的大力投入，越來(lái)越多的工作者加入到科學(xué)研究的隊(duì)伍中，因此各院校辦學(xué)規(guī)模不斷擴(kuò)大，學(xué)生人數(shù)逐年增加，但高校實(shí)驗(yàn)教學(xué)硬件滯后，實(shí)驗(yàn)室普遍存在著人員密集、實(shí)驗(yàn)室空間狹小、實(shí)驗(yàn)用品使用頻率極高等情況,造成其污染系數(shù)增加[3-4]。我國(guó)首部《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》已于2004年11月12日經(jīng)國(guó)務(wù)院發(fā)布實(shí)施，這標(biāo)志著我國(guó)對(duì)病原微生物相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的生物安全管理的高度重視[5]，廣大學(xué)者在實(shí)驗(yàn)室微生物污染管理等方面也進(jìn)行了大量有意義的探索[6-7]，但主要還是集中于臨床醫(yī)學(xué)，而對(duì)于植物病原微生物實(shí)驗(yàn)室中雜菌的污染及來(lái)源研究較少，目前就植物病原微生物實(shí)驗(yàn)室污染雜菌種類及預(yù)防措施知之甚少。

蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院某微生物實(shí)驗(yàn)室某一時(shí)期也出現(xiàn)了雜菌嚴(yán)重污染培養(yǎng)的微生物的情況，為確定雜菌種類及其來(lái)源，本研究以該微生物實(shí)驗(yàn)室為研究場(chǎng)所，對(duì)植物病原微生物實(shí)驗(yàn)室的雜菌進(jìn)行檢測(cè)，并且結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對(duì)主要污染物進(jìn)行鑒定，確定其種類。通過(guò)將檢測(cè)到的菌種與空氣中常見(jiàn)微生物進(jìn)行對(duì)比以及將無(wú)菌間和常規(guī)操作間菌物種類進(jìn)行對(duì)比，分析雜菌來(lái)源，以期做到有針對(duì)性的預(yù)防。本研究旨在為微生物實(shí)驗(yàn)室微生物污染的預(yù)防、科研環(huán)境的改善提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 房間布局及采樣點(diǎn)安排

微生物實(shí)驗(yàn)室由兩部分組成，無(wú)菌間和常規(guī)操作間。無(wú)菌間并排放置3臺(tái)超凈工作臺(tái)，每個(gè)超凈工作臺(tái)臺(tái)面和工作臺(tái)下地面設(shè)為采樣點(diǎn)，各采樣點(diǎn)3個(gè)重復(fù)；常規(guī)操作間主要由15 m2的長(zhǎng)方形試驗(yàn)臺(tái)組成，設(shè)置4個(gè)采樣點(diǎn)，分別位于試驗(yàn)臺(tái)的每個(gè)角上。

1.2 實(shí)驗(yàn)室污染菌檢測(cè)

采用平皿暴露法收集實(shí)驗(yàn)室污染的雜菌[8]，在無(wú)菌間的3臺(tái)超凈臺(tái)內(nèi)部和超凈臺(tái)地面分別隨機(jī)擺放3皿馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)，在常規(guī)操作間的試驗(yàn)臺(tái)4個(gè)拐角分別放一皿PDA，同時(shí)揭開(kāi)培養(yǎng)皿蓋子，放置5 min后蓋上蓋子。

1.3 除菌與再次檢測(cè)

用滅菌后的潮濕抹布徹底擦拭超凈臺(tái)內(nèi)外，噴灑75%的酒精于超凈臺(tái)內(nèi)部，并用滅菌濾紙?jiān)俅尾潦茫缓笥酶蓛舻耐习褜o(wú)菌間內(nèi)的地面充分拖2遍，隨后打開(kāi)3臺(tái)超凈工作臺(tái)電源開(kāi)關(guān)，將風(fēng)速調(diào)為中檔吹10 min，關(guān)掉電源之后收集超凈臺(tái)內(nèi)和地面的微生物，方法同1.2。

1.4 微生物培養(yǎng)與鑒定

1.4.1微生物培養(yǎng) 將收集微生物的培養(yǎng)皿封口，于微生物培養(yǎng)箱內(nèi)在22 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)48 h，按照菌落顏色和菌落形態(tài)統(tǒng)計(jì)每個(gè)平板中所見(jiàn)菌落數(shù)，并按采樣點(diǎn)分類登記，純化雜菌的菌落，再培養(yǎng)6 d后觀察菌落特征，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定菌種。

1.4.2主要污染菌物鑒定 選擇菌落總數(shù)大于等于2的菌物進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定[9]。細(xì)菌的16 S序列擴(kuò)增參考胡進(jìn)玲等[10]的方法。真菌全基因組使用真菌 DNA 提取試劑盒(型號(hào)為D3195-1)，用引物ITS1(AGGAGAGTCGTAACAAGGT)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATAT GC)[11-12]，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?體系20 μL體系，具體為0.5 μL模板DNA，0.5 μL引物ITS1，0.5 μL引物ITS4，10 μL Eco taq mixture，8.5 μL ddH2O。反應(yīng)條件為裂解95 ℃，2 min，退火至53 ℃，20 s，復(fù)性72 ℃，1 min 40 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)，最終延伸72 ℃，7 min，擴(kuò)增結(jié)束后以4 ℃保存[12]。然后基于BLAST軟件對(duì)所測(cè)得序列和NCBI中的核酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，找出與目的序列同源性高且通過(guò)正式發(fā)表的序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析，再采用MEGA6以鄰接法(neighbor-joining,NJ)對(duì)其構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。設(shè)置1 000次隨機(jī)抽樣，計(jì)算自引導(dǎo)值(bootstrap)，以評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的置信度[10,13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)室污染微生物統(tǒng)計(jì)與鑒定

將雜菌進(jìn)行純化，并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，通過(guò)菌落顏色和形態(tài)特征統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)的雜菌種數(shù)和菌落數(shù)。結(jié)果顯示，供試培養(yǎng)皿中菌落總數(shù)大于等于2的微生物有11種，通過(guò)其在PDA中的形態(tài)特征(如圖1)，可以判斷，其中有3種真菌、8種細(xì)菌，將其編號(hào)為1～11號(hào)，通過(guò)菌落形態(tài)和顯微觀察，確定1號(hào)污染物為青霉(Penicilliumsp.)，而其他雜菌未知，故對(duì)2～11號(hào)微生物進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。通過(guò)觀察2、3號(hào)真菌的分生孢子和分生孢子梗形態(tài)(圖2)，結(jié)合其分子生物學(xué)鑒定結(jié)果(圖3)，確定2號(hào)真菌為殼皮盤(pán)菌(Pezizaostracoderma)，3號(hào)真菌為枝孢樣枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)。通過(guò)分子生物學(xué)鑒定，確定4～11號(hào)細(xì)菌分別為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、海迪茨氏菌(Dietziamaris)、球形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobiformis)、微球菌屬(Micrococcussp.)、馬西利亞菌屬(Massiliasp.)、玫瑰色庫(kù)克菌(Kocuriarosea)、嗜根考克氏菌(K.rhizophila)、萎蔫短小桿菌(Curtobacteriumflaccumfaciens) (圖4)。

圖1 1～11號(hào)污染菌物在培養(yǎng)皿里的菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology of No.1～No.11 fungal contaminants in petri dish

a～k分別代表1～11號(hào)污染物菌落。

a～k represents the microorganism colony of No.1～No11.

圖2 2號(hào)、3號(hào)真菌孢子和分生孢子梗Fig. 2 Spores and conidiophores of No.2 and No.3 fungal contaminants

a、b為2號(hào)真菌的分生孢子和分生孢子梗；c、d為3號(hào)真菌分生孢子和分生孢子梗。

a, b for no.2 fungi conidium and conidiophore; c, d for no.3 fungi conidium and conidiophores.

圖3 2、3號(hào)真菌污染物與相關(guān)菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree of No.2, No.3 fungi and their relatives

圖4 4～11號(hào)細(xì)菌污染物與相關(guān)菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree of No.4～No.11 bacteria and their relatives

通過(guò)統(tǒng)計(jì)與鑒定，本研究發(fā)現(xiàn)(表1)，病原微生物實(shí)驗(yàn)室中造成污染的優(yōu)勢(shì)菌種依次為玫瑰色庫(kù)克菌、球形節(jié)桿菌、海迪茨氏菌、青霉、微球菌屬，菌落總數(shù)分別為28、28、23、15、13個(gè)，是最主要的防范對(duì)象。通過(guò)形態(tài)和顯微鏡觀察，本研究發(fā)現(xiàn)，3種污染真菌生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)孢迅速且孢子量極大，對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境威脅極大。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室中無(wú)菌間和試驗(yàn)臺(tái)空間的污染物檢測(cè)，本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)菌間的雜菌種類遠(yuǎn)多于試驗(yàn)臺(tái)空間，且包含了所有試驗(yàn)臺(tái)空間的污染菌種類。因此，結(jié)果表明，造成微生物試驗(yàn)污染最嚴(yán)重的地方為無(wú)菌間，在日常試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格滅菌。

2.2 無(wú)菌間除菌操作效果評(píng)估

對(duì)無(wú)菌間的超凈臺(tái)進(jìn)行無(wú)菌抹布擦拭、噴灑酒精、開(kāi)機(jī)吹風(fēng)等操作后，超凈工作臺(tái)面5種優(yōu)勢(shì)菌中，4種徹底消失，剩余1種平均菌落數(shù)減少了66.67%；對(duì)于超凈工作臺(tái)面全部雜菌而言，處理前后雜菌種類下降了64%，處理前后均有的3種菌(枝孢樣枝孢霉、球形節(jié)桿菌、馬西利亞菌屬)經(jīng)處理后菌落數(shù)量分別下降了50%、67%和0；超凈工作臺(tái)地面擦拭后雜菌種類減少了9%，未徹底清除的菌中，青霉、枝孢樣枝孢霉、解淀粉芽孢桿菌等7種雜菌的平均菌落數(shù)減少，減少范圍為29.73%～80.36%(表2)。因此，徹底擦拭超凈工作臺(tái)、噴灑酒精等操作可有效減少微生物培養(yǎng)中的污染。

表1 微生物菌落在供試培養(yǎng)基中出現(xiàn)情況Table 1 Microbial colonies in the test medium

〇表示該種菌在超凈臺(tái)或試驗(yàn)臺(tái)被檢測(cè)到。

〇 indicates this kind of microorganism was detected in benchtop or experiment table.

表2 除菌操作前后超凈臺(tái)11種菌平均菌落數(shù)Table 2 The average colony count of 11 strains before and after sterile operation

同列不同小寫(xiě)字母表示不同處理在0.05水平上差異顯著(P<0.05)。

Different lowercase letters within the same column indicate significant difference at the 0.05 level.

3 討論與結(jié)論

本研究采用PDA平板暴露法結(jié)合微生物形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，可以快速準(zhǔn)確地統(tǒng)計(jì)出實(shí)驗(yàn)室的污染菌，通過(guò)將檢測(cè)到的菌種與空氣中常見(jiàn)微生物對(duì)比，分析雜菌來(lái)源，在對(duì)污染物充分了解的情況下進(jìn)行有針對(duì)性的預(yù)防。本研究在微生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)到的菌中，青霉和馬西利亞菌被報(bào)道廣泛分布于自然界空氣中[14]，其余菌種均不是空氣中常見(jiàn)微生物[15-16],說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)室污染的主要原因不是由實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外空氣流通引起的。據(jù)報(bào)道，球形節(jié)桿菌、微球菌屬、海迪茨氏菌主要分布于土壤中，分別用于修復(fù)污染農(nóng)田、硝酸還原、降解原油污染[17-19]；殼皮盤(pán)菌、枝孢樣枝孢霉為腐生真菌，主要存在于土壤，枯萎植物及糞便中[20-21]；玫瑰色庫(kù)克菌、嗜根考克氏菌、萎蔫短小桿菌為3種病原菌，主要危害植物種子、根部和葉片[22-24]；解淀粉芽孢桿菌為一種植物內(nèi)生細(xì)菌，生防效果明顯[10,25]。因此可以確定，這些雜菌可能是研究人員在微生物研究過(guò)程中操作不當(dāng)引起的污染。從雜菌來(lái)源來(lái)看，嚴(yán)格規(guī)范試驗(yàn)操作是減少污染最主要的途徑，因?yàn)槲廴揪幸灿锌諝庵谐Ｒ?jiàn)兩種菌，因此減少實(shí)驗(yàn)室的內(nèi)外空氣流動(dòng)也十分必要。

對(duì)于目前實(shí)驗(yàn)室已有雜菌，應(yīng)采用有效除菌操作。本研究中的除菌操作雖為常規(guī)除菌操作，但可以將超凈臺(tái)內(nèi)青霉、殼皮盤(pán)菌、解淀粉芽孢桿菌、海迪茨氏菌、微球菌屬、玫瑰色庫(kù)克菌和萎蔫短小桿菌完全清除，將枝孢樣枝孢霉等兩種菌的菌落數(shù)減少，可見(jiàn)除菌效果明顯。因此在日常微生物試驗(yàn)中，常規(guī)除菌操作必不可少。本研究發(fā)現(xiàn)，該方法操作不僅簡(jiǎn)單，而且能高效除菌，其原因在于試驗(yàn)前打開(kāi)超凈工作臺(tái)吹風(fēng)，使用滅菌濕抹布擦拭超凈臺(tái)內(nèi)外，用滅菌拖把清潔超凈臺(tái)周圍地面，這些操作可將一些生長(zhǎng)于儀器表面或地面的污染物清除，且制造相對(duì)潮濕的試驗(yàn)環(huán)境，減少真菌孢子的飛濺傳播[26-27]，同時(shí)，超凈臺(tái)吹風(fēng)可將浮游在空氣中的微生物或孢子吸附進(jìn)入超凈臺(tái)下方的過(guò)濾器中[28]，避免造成試驗(yàn)污染；試驗(yàn)前噴灑75%的酒精于超凈臺(tái)內(nèi)，可同時(shí)殺死空氣中和儀器表面的微生物[29-30]。

雖然通過(guò)超凈臺(tái)擦拭、酒精噴霧、拖地等常規(guī)除菌操作可以使超凈臺(tái)內(nèi)9種雜菌的平均菌落數(shù)減少，但在除菌操作前后差異不顯著，因此在微生物試驗(yàn)過(guò)程中，必須結(jié)合其他滅菌措施，比如紫外滅菌。紫外線對(duì)微生物的DNA 及RNA具有強(qiáng)大破壞力，使微生物喪失生存和繁殖能力從而消滅細(xì)菌、病毒，達(dá)到消毒滅菌成效[31-34]。據(jù)夏祖英和汪國(guó)珍[35]報(bào)道，距離1 m，15 W紫外線照射空氣2 h，可以完全消滅超凈臺(tái)里的污染菌，因此在試驗(yàn)人員晚上離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，可以打開(kāi)無(wú)菌間和常規(guī)操作間的紫外燈，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的空氣進(jìn)行徹底滅菌。因?yàn)樵诒狙芯恐?，被檢測(cè)到的11種主要污染菌種中，其中8種為細(xì)菌污染物，因此在試驗(yàn)允許的前提下，可以在培養(yǎng)基中加一定量的抗生素，比如青霉素、鏈霉素等，來(lái)預(yù)防細(xì)菌的污染[36-37]。其次，正確的試驗(yàn)操作方法也可避免試驗(yàn)污染，如在靠近酒精燈周圍空間進(jìn)行微生物試驗(yàn)，酒精燈外焰的加熱溫度為400～500 ℃，可殺死其周圍空氣里的浮游微生物及孢子[38-39]。

綜上所述，采用PDA平板暴露法結(jié)合微生物形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定，可以快速準(zhǔn)確地鑒定出實(shí)驗(yàn)室的污染菌種類，分析出雜菌主要來(lái)源，做出有針對(duì)性的預(yù)防。該方法不僅適用于微生物實(shí)驗(yàn)室，在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室、分子實(shí)驗(yàn)室和植物組織培養(yǎng)室的微生物污染檢測(cè)、鑒定、預(yù)防等方面都具有重要的借鑒意義[40-42]。

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