不同基質(zhì)對‘寒香蜜’葡萄插條生長及VvLFY和VvAP1基因表達(dá)的影響

李曉鵬，安顏穎，上官凌飛，房經(jīng)貴*

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/江蘇省果樹品種改良與種苗繁育工程中心，江蘇南京 210095；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇南京 210095；）

開花是植物生命過程中的重要環(huán)節(jié)，它標(biāo)志著植物從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變，植物花發(fā)育機(jī)理也是植物發(fā)育生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。植物花發(fā)育過程大致可分三個階段：開花決定（成花誘導(dǎo)）、花的發(fā)端和花器官的發(fā)育。開花決定階段中，莖端分生組織形態(tài)上沒有變化，但是在生理生化和基因表達(dá)層面發(fā)生了改變[1]，影響這一階段的因素主要是光照、溫度、水分和營養(yǎng)條件等；花的發(fā)端指莖端分生組織向花分生組織轉(zhuǎn)變，此過程由花分生組織決定基因控制[2]；花器官的發(fā)育過程中，花器官特征基因決定花器官的特征，即決定花器官原基發(fā)育為各花器官。當(dāng)植物內(nèi)外環(huán)境達(dá)到合適的條件時，開花基因就會啟動花分生組織特征基因，使植物從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變到生殖生長。

目前，人們通過對擬南芥和金魚草等模式植物，進(jìn)行了大量的關(guān)于成花過程相關(guān)基因的研究，對花發(fā)育分子機(jī)制網(wǎng)絡(luò)已有一定的認(rèn)識[3-4]。LEAFY（LFY）基因在花發(fā)育中起關(guān)鍵作用[3,5]，是決定從營養(yǎng)生長向生殖生長階段轉(zhuǎn)變的重要元件[6-7]，還參與維持花分生組織的正常功能、成花啟動、防止花分生組織的逆轉(zhuǎn)等功能[8-10]。但是該基因在植物組織內(nèi)的表達(dá)并不呈現(xiàn)專一性[11]。APETALA1（AP1）基因即是花分生組織特征基因，屬于MADS-box基因家族[12]，AP1基因是LFY基因的直接靶基因[13]，LFY基因靠激素調(diào)控路徑正向調(diào)控AP1基因的表達(dá)[14-15]，AP1基因在LFY基因的下游表達(dá)，又正向作用于LFY基因的表達(dá)。

葡萄是世界范圍內(nèi)的重要果樹，葡萄花發(fā)育有很多獨(dú)有的特點(diǎn)[16]，研究其花器官的發(fā)育和果實(shí)的形成具有重要的理論和實(shí)踐意義。葡萄成花周期在一年以上，春季花序從芽側(cè)生分生組織（原基）發(fā)端，夏季進(jìn)入休眠狀態(tài)，翌年結(jié)束休眠產(chǎn)生花與果實(shí)[17-18]。扦插育苗一直是葡萄苗木繁殖的主要方法，具有育苗時間短、繁殖量大、操作簡單、能保持品種優(yōu)良性狀等優(yōu)點(diǎn)[19]。扦插過程中，葡萄插條的生長狀況受到育苗基質(zhì)的透水、透氣能力和肥力影響，從而影響著葡萄苗木的育苗周期和經(jīng)濟(jì)效益。在前期的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，部分葡萄插條會長出花序，并且不同扦插基質(zhì)之間的插條對比尤為明顯。針對這一現(xiàn)象，本研究選用不同物理性質(zhì)的基質(zhì)，通過對不同基質(zhì)條件下葡萄插條花發(fā)育關(guān)鍵基因（LFY和AP1）表達(dá)的研究和分析，找出扦插基質(zhì)、成花關(guān)鍵基因和插條花序生長之間的關(guān)系，進(jìn)而為葡萄花發(fā)育調(diào)控提供理論參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院葡萄實(shí)驗(yàn)大棚中進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種為歐美雜種‘寒香蜜’（Reliance）。在2015年12月，選取生長健壯且粗度較為一致的枝條，修剪為1 m的插條，層積放置到2016年3月14日，修剪成含兩個芽的插條用于試驗(yàn)。插條下剪口靠節(jié)斜剪，上剪口距離芽眼3 cm平剪，用清水浸泡插條24 h左右，NAA800倍液處理15 s后插于營養(yǎng)缽中。扦插基質(zhì)主要采用珍珠巖、蛭石和營養(yǎng)土以及3種基質(zhì)的混合物，扦插基質(zhì)具體配比如表1所示。每種基質(zhì)處理設(shè)4次重復(fù)，每重復(fù)20株，每處理共80株。

1.2 試驗(yàn)試劑

RNaseFree DNase酶Ⅰ、Ex-Taq酶、dNTPs、DNA Marker、SYBRGreenⅠ購自日本TakaRa公司；SuperScript Ⅱ反轉(zhuǎn)錄酶、RNaseOUTTM Ribonuclease Inhibitor購自Invitrogen公司。

1.3 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)

鑒于葡萄花發(fā)育相關(guān)基因的重要性，根據(jù)植物成花途徑中有關(guān)基因的上下游關(guān)系、相互作用方式以及功能特點(diǎn)，上調(diào)基因VvLFY和花器官特異性基因VvAP1作為研究對象[20]，選取UBI作為內(nèi)參基因。引物序列（表2），由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 RNA提取和cDNA合成

分別于2016年3月23日、3月29日、4月3日、4月9日4個時期采集插條嫩枝，液氮研磨成粉備用。葡萄RNA的提取采用CTAB法[21-22]，參照RNase Free DNase酶Ⅰ說明書進(jìn)行DNA消化。以總RNA為模板，參照SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。cDNA放于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量PCR

表1 各處理基質(zhì)配比用量（體積比）Table 1 Matrix combinations and amounts of different treatments (V/V)

表2 引物用途及序列Table 2 Sequence information of primers

參照已有研究報(bào)道[23-25]，分別取2 μg葡萄芽不同發(fā)育時期的cDNA為模板和相應(yīng)的引物。利用Rotor-Gene熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，反應(yīng)體系按SYBR GreenⅠ（TOYOBO, Osaka，Japan）說明書進(jìn)行。優(yōu)化后的反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃預(yù)變性20 s；58 ℃預(yù)變性20 s；72 ℃預(yù)變性20 s；45個循環(huán)。利用溶解曲線分析引物的特異性擴(kuò)增。每組3次重復(fù)。試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)用LinReg PCR和Rotor-Gene軟件計(jì)算，利用相對定量分析法進(jìn)行分析[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基質(zhì)插條生長狀況

2.1.1 苗木扦插成活率

由于空間原因，每個處理的插條首先集中扦插于大營養(yǎng)缽中，2016年4月15日插條基本成活，再分裝于小營養(yǎng)缽中。分裝過程中對不同扦插基質(zhì)的插條根系及地上部的生長情況進(jìn)行測量，結(jié)果見圖1和表3。由表3可知，6種基質(zhì)中的插條成活率都在90%以上，基質(zhì)A最低，成活率為91%，其它基質(zhì)的成活率幾乎為100%。

2.1.2 苗木新根數(shù)量及長度

由表3可知，4月15日，基質(zhì)A和基質(zhì)B插條根部大部分處于白色的愈傷組織階段，基質(zhì)B生有零星的新根。其它4種基質(zhì)中，扦插條均長出大量的新根，新根數(shù)目由低到高的處理分別為基質(zhì)D、基質(zhì)C、基質(zhì)E和基質(zhì)F，平均數(shù)目分別為27.6條、31.4條、53.2條和70.3條。新生根系的長度與根數(shù)目呈正相關(guān)，根數(shù)目越多，新根越長。根平均長度最短的是基質(zhì)B，為1.344 cm，最長的為基質(zhì)F，為8.203 cm。

圖1 4月15日各個處理扦插苗生長情況Figure 1 Growth status of grape cuttings on April 15

2.1.3 苗木新生枝條生長情況

4月15日，各處理新生枝條的長度由低到高的順序?yàn)榛|(zhì)B、基質(zhì)A、基質(zhì)C、基質(zhì)D、基質(zhì)E和基質(zhì)F，高度分別是1.7 cm、2.2 cm、3.6 cm、6.9 cm和7.7 cm，基質(zhì)A和基質(zhì)B、基質(zhì)C和基質(zhì)D的新生枝條和根系的生長量不成正比，基質(zhì)A并沒有長出新根，這種情況同樣出現(xiàn)在基質(zhì)C和基質(zhì)D兩種處理中，基質(zhì)D的新根數(shù)量少于基質(zhì)C，但其地上部的生長狀況好于基質(zhì)C。

到5月30日時，地上部的枝條生長情況與4月15日類似，基質(zhì)A和基質(zhì)B中的枝條長勢矮小，其它4種基質(zhì)長勢健壯，新枝的高度和節(jié)間長度明顯大于前兩種基質(zhì)的插條。

2.2 不同基質(zhì)插條成花情況

表3 4月15日不同基質(zhì)組合的葡萄插條根系生長情況Table 3 Effect of different substrate combinations on roots development of grape cuttings on April 15

隨著插條的生長，3月29日基質(zhì)E和基質(zhì)F開始出現(xiàn)花苞，但是花苞產(chǎn)生后持續(xù)了一個月左右，最終枯萎脫落。期間，花苞的大小并沒有太大的變化。基質(zhì)C、基質(zhì)D的插條地上部發(fā)育遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于基質(zhì)A和基質(zhì)B的插條，但是這4個處理并沒有花苞出現(xiàn)。

2.3 不同基質(zhì)成花基因的表達(dá)情況分析

根據(jù)葡萄插條的生長動態(tài)以及花苞抽生情況，選取了4個時期的插條為材料，進(jìn)行成花基因的表達(dá)分析，基因分別為VvLFY和VvAP1。

VvLFY基因在不同基質(zhì)的插條中的表達(dá)趨勢如圖2所示，不同處理的表達(dá)趨勢不同。VvLFY在4個時期的表達(dá)整體呈下降趨勢?；|(zhì)E和F處理中，VvLFY在3月23日和3月29日的表達(dá)量明顯高于其它4種處理，4月3日，基質(zhì)E和F處理的基因表達(dá)量快速下降，表達(dá)量降低到與其它4種處理一致的水平。但是基質(zhì)C和基質(zhì)D的插條VvLFY表達(dá)量變化雖然不是特別明顯，但是總體上的趨勢呈先上升，在3月29日到達(dá)高峰，隨后降低到一致水平。

圖2 不同時期VvLFY基因的表達(dá)水平變化趨勢Figure 2 The variation of expression levels of VvLFY at different periods

VvAP1基因在不同基質(zhì)插條中的表達(dá)趨勢如圖3所示，VvAP1基因的表達(dá)呈先上升后下降的趨勢，但是有花苞形成的基質(zhì)E和F的插條的VvAP1表達(dá)量在3月23日、3月29日和4月3日的表達(dá)量高于其他基質(zhì)中的插條，6種處理在4月3日的表達(dá)量處于高峰，4月9日各基質(zhì)的插條VvAP1基因表達(dá)量下降，基質(zhì)E和F的插條VvAP1表達(dá)量在6種基質(zhì)處理中處于中游水平，而前期基因相對表達(dá)量最低的基質(zhì)A和B處理的基因表達(dá)量在4月9日表達(dá)最高。

3 討論

3.1 不同基質(zhì)對葡萄扦插效果的影響

在扦插的過程中，選擇適宜的基質(zhì)是決定扦插苗生產(chǎn)是否健康的重要因素。前人的研究表明，基質(zhì)的種類、不同配比對插穗生根影響差異顯著[27]，不同基質(zhì)的配比對基質(zhì)的理化性質(zhì)改變明顯[28]。適宜的基質(zhì)與基質(zhì)的含水量、孔隙度和pH密切相關(guān)，基質(zhì)的含水量高，則降低基質(zhì)的透氣性，插穗下端易腐爛；基質(zhì)的含水量過低，雖然增加了基質(zhì)的透氣性，但插穗可能因缺水導(dǎo)致枯萎現(xiàn)象?？紫抖鹊母叩蜎Q定了基質(zhì)中氣相和液相的比例，從而影響插穗的成活率[29]。

圖3 不同時期VvAP1基因的表達(dá)水平變化趨勢Figure 3 The variation of expression levels of VvAP1 at different periods

本試驗(yàn)的結(jié)果表明，在不同的基質(zhì)中，插條的根系發(fā)育、地上部的生長均有明顯的差異。從生根情況看，所有含珍珠巖的基質(zhì)插條的生長狀況良好，其中，基質(zhì)E和基質(zhì)F優(yōu)于其他處理。插條的生根狀況會受到基質(zhì)性質(zhì)的影響。混合基質(zhì)中珍珠巖的持水性較差，但透氣性較好，在經(jīng)常澆水的前提下，有利于根系的形成，提高成活率和生根率；蛭石的吸水保水能力強(qiáng)，透氣性比珍珠巖略差，含有蛭石的處理插條生長情況比珍珠巖略差；泥炭土的透氣性最差，結(jié)果表明泥炭土對葡萄插條的生長不利。

3.2 不同基質(zhì)對葡萄扦插成花的影響

在本研究的6個處理中，最終僅有兩種處理的插條產(chǎn)生了花苞，兩種插條的共同點(diǎn)是初期抽生出花苞，最終根系及新生枝條生長狀況最好。高等植物的營養(yǎng)生長和生殖生長互相影響，扦插苗脫離母體，花苞的生長得益于枝條內(nèi)儲存的營養(yǎng)物質(zhì)，基質(zhì)E和F的插條所處的環(huán)境適宜，促進(jìn)了花的分化，因此著生了花序，但在生長過程中由于營養(yǎng)生長的旺盛，給花序的營養(yǎng)供給不足，花序掉落，這也證明了扦插苗的營養(yǎng)生長占有主要的地位。

3.3 成花基因的表達(dá)對葡萄扦插成花的影響

LFY基因是花分生組織的特異性基因。開花誘導(dǎo)后，植物的LFY基因被激活，LFY在頂端花序分生組織的周邊積累，然后在花原基進(jìn)行強(qiáng)表達(dá)，接著在花發(fā)育過程中繼續(xù)表達(dá)[5]。LFY基因?qū)Ψ稚M織的營養(yǎng)性生長起抑制作用，使更多的分生組織細(xì)胞轉(zhuǎn)向花原基的形成[13,30]。本試驗(yàn)中，各個處理的VvLFY基因均有一定量的表達(dá)，這表明葡萄插條全部具有成花的潛力?；|(zhì)E和基質(zhì)F的VvLFY基因表達(dá)量較高，促進(jìn)了花序的形成，而其它處理的VvLFY基因表達(dá)量較低，對抽生花序的影響較低，最終由于插條的生長狀況不良導(dǎo)致不能形成花苞。

在高等植物的成花過程中，AP1基因是花器官發(fā)育的相關(guān)基因，是一個關(guān)鍵的調(diào)控點(diǎn)，AP1基因的表達(dá)受LFY基因的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)VvAP1基因的表達(dá)量變化滯后于VvLFY的表達(dá)量，說明了VvLFY正向調(diào)節(jié)VvAP1的表達(dá)，但4月3日VvAP1仍然有一個表達(dá)高峰，此時的VvLFY的表達(dá)量已經(jīng)降低，這表明VvAP1基因的表達(dá)受多種因素的調(diào)節(jié)，不僅僅限于VvLFY基因。VvAP1基因在插條的生長過程中呈先升高后降低的趨勢，表明所有插條的花發(fā)育進(jìn)程在萌芽期沒有中斷，只是由于環(huán)境因素并沒有產(chǎn)生花序，下一步的研究將對此時期的芽結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察分析。

4 結(jié)論

成花是高等植物最關(guān)鍵的生命過程，決定繁育的成敗，由內(nèi)在控制元件和外部環(huán)境共同控制[31-32]。本研究通過不同配比的基質(zhì)扦插葡萄枝條，發(fā)現(xiàn)透氣性更好的基質(zhì)珍珠巖、蛭石中有利于插條的生長，也就是珍珠巖和蛭石混合基質(zhì)或者珍珠巖基質(zhì)中的插條表現(xiàn)更好，甚至能生長出花序，其他4種基質(zhì)的插條新枝發(fā)育不良，不能生長出花序。成花關(guān)鍵基因LFY和AP1在插條嫩枝的表達(dá)說明外部環(huán)境能影響插條成花的潛力；雖然后兩種基質(zhì)處理的插條新枝生長良好，能促進(jìn)花序形成，但由于營養(yǎng)物質(zhì)過多消耗在根和新枝等營養(yǎng)器官，導(dǎo)致花序發(fā)育不良、脫落，說明生殖生長建立在營養(yǎng)生長的基礎(chǔ)之上[33]。

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