葡萄WUSCHEL-related homeobox（WOX）家族基因鑒定與分析

王鵬飛，吳新穎，楊立英，王顯蘇，張倩倩，陳迎春，王珊，慕茜，陳萬鈞*，王詠梅*（山東省葡萄研究院，山東濟(jì)南 250100）

與其它果樹一樣，葡萄有一定的生長發(fā)育規(guī)律。葡萄的年周期發(fā)育包括生長期與休眠期，而這種年周期發(fā)育與氣候密切相關(guān)。在這種周期發(fā)育中，葡萄進(jìn)行萌芽、生長、開花、結(jié)果等一系列的生命活動。這些生命活動涉及復(fù)雜的生物學(xué)過程。例如，葡萄冬芽發(fā)生花芽分化，新梢莖頂端分生組織分化出芽、葉片、卷須和花等器官，新梢的伸長，卷須與花的相互轉(zhuǎn)化等，而這些生物學(xué)過程都與頂端分生組織相關(guān)[1-2]。

WUSCHEL related homeobox（WOX）家族基因是一類含有homeobox結(jié)構(gòu)域，與植物分生組織干細(xì)胞維持相關(guān)的基因。目前已有很多關(guān)于不同植物WOX家族基因鑒定與分析的報道。例如在擬南芥中，研究者發(fā)現(xiàn)了WUSCHEL（WUS）基因和WOX1-15基因[3-7]。WOX家族基因的功能涉及分生組織干細(xì)胞維持，胚尖-基底極性模式和側(cè)生器官，以及側(cè)生器官的發(fā)育[3-7]。此外，一些研究顯示，部分WOX基因家族成員可能涉及植物器官的演變。例如川苔草科植物（Podostemaceae）中新梢-葉混合器官的演變[8]。

基于系統(tǒng)發(fā)育分析以及在不同植物中的分布，WOX家族基因可以被分為三大組。第一組是現(xiàn)代分支（主要存在在種子植物中），該分支包括WUS、WOX1、WOX2、NS/WOX3、WOX4、WOX5、WOX6以及WOX7類基因；第二組是中間分支（在維管植物中可以被發(fā)現(xiàn)，例如石松類植物），包括WOX8、WOX9、WOX11、WOX12以及WOX15類基因；第三組是祖先/基本分支（在維管植物和非維管植物中都可以被發(fā)現(xiàn)，例如苔蘚和綠藻），包括WOX10、WOX13以及WOX14類基因[8-11]。擬南芥WUS（AtWUS）基因涉及莖尖分生組織的干細(xì)胞維持[12]。WOX3類基因涉及葉緣分生組織的干細(xì)胞維持[13-14]以及側(cè)生萼片、托葉的發(fā)育[4,15-16]。WOX4類基因涉及維管束（形成層分生組織）的干細(xì)胞維持[8,17-18]。WOX5類基因在根尖分生組織的干細(xì)胞維持中發(fā)揮著重要作用[19]。WOX8和WOX9類基因在調(diào)控合子發(fā)育與胚胎軸形成的過程中功能是冗余的。而有的研究報道，擬南芥WOX9類基因還與莖尖分生組織的調(diào)控相關(guān)[19]。WOX13類基因被證實(shí)涉及植物假隔膜的發(fā)育，側(cè)根的形成和花的生長轉(zhuǎn)變[20-21]。

WOX家族基因被報道具有一定的時空特異性表達(dá)模式，而這種時空特異性表達(dá)被認(rèn)為與各自的特殊功能相關(guān)聯(lián)[8]。擬南芥WUS（AtWUS）基因特異表達(dá)在一個特殊的區(qū)域，該區(qū)域位于莖尖分生組織的干細(xì)胞中心。擬南芥WUS在一個通過CLV3介導(dǎo)的反饋機(jī)制維持干細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要作用，CLV3是一種能夠限制莖尖分生組織大小的能與亮氨酸富集重復(fù)受體激酶互作的多肽[7,22]。擬南芥WOX4（AtWOX4）在形成層分生組織強(qiáng)烈表達(dá)，并在維管束干細(xì)胞維持中起到重要作用[17,23]。擬南芥WOX5（AtWOX5）只在根靜止中心表達(dá)，而根靜止中心是被干細(xì)胞所包圍的一種區(qū)域[7,24]。研究表明，擬南芥WOX5對于根尖分生組織的干細(xì)胞維持十分關(guān)鍵，其在一個通過CLE40介導(dǎo)的反饋機(jī)制維持干細(xì)胞的過程中具有重要作用[7,25]。而擬南芥WOX13（AtWOX13）主要在分生組織中表達(dá)[21]。因此，WOX家族基因在特定器官和細(xì)胞類型中的表達(dá)暗示其可能在這些特定器官和細(xì)胞中發(fā)揮重要作用[26]。

之前的研究報道了葡萄WOX4基因在轉(zhuǎn)化煙草后顯著增加了煙草莖原始體結(jié)構(gòu)的數(shù)量，暗示其可能有調(diào)控干細(xì)胞的功能[27]。之前的研究也有對該家族其他成員功能的分析，例如WOX2、WOX3、WOX9、WOX11在體細(xì)胞胚發(fā)生中的功能[28]。然而對葡萄WOX家族成員的表達(dá)模式、蛋白結(jié)構(gòu)、啟動子以及進(jìn)化分析的研究較少。本研究利用葡萄最新版本的基因組數(shù)據(jù)，從全基因范圍鑒定葡萄WOX家族基因并對其表達(dá)模式、蛋白結(jié)構(gòu)、啟動子、進(jìn)化中受到的選擇壓力及密碼子使用偏好性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 序列篩選

葡萄的蛋白、CDs及啟動子數(shù)據(jù)從最新版本葡萄基因組數(shù)據(jù)庫（V2.0）中獲得（http://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/），用于基因組測序的葡萄品種為黑比諾（Vitis vinifera L. CV. Pinot Noir）。我們用擬南芥全部WOX家族基因的編碼蛋白進(jìn)行本地BLASTP（E＜0.001），搜索葡萄中全部的WOX蛋白，從而鑒定葡萄WOX家族基因。利用在線軟件SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）來確定這些搜索到的蛋白是否具有完整的homeobox結(jié)構(gòu)域，如不含有完整的homeobox結(jié)構(gòu)域則篩除。

1.2 多重序列比對與進(jìn)化樹分析

我們利用Clustal Omega在線軟件（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo）進(jìn)行蛋白多重序列比對分析。MEGA6.0軟件被用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，方法為鄰接法（Neighbor-Joining tree）。

1.3 保守基序（motif）分析

Multiple Em for Motif Elicitation (MEME) suite 4.11.1（http://meme.nbcr.net/meme/）在線軟件被用于分析葡萄WOX蛋白的保守基序（motif）。

1.4 基因表達(dá)分析

葡萄WOX家族基因在各個組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)來源于前人研究的芯片表達(dá)譜。數(shù)據(jù)收集自Plant Expression Database（http://www.plexdb.org/）數(shù)據(jù)庫以及GEO數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/）。芯片表達(dá)譜結(jié)果的RMA-normalized signal intensity value作為標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)量。

1.5 啟動子分析

PLANTCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線軟件被用于分析葡萄WOX家族基因啟動子的順式調(diào)控元件。

1.6 密碼子使用偏好性分析

CodonW1.4軟件被用于計算葡萄WOX家族基因的密碼子使用偏好性指數(shù)。

1.7 選擇壓力分析

Codeml program under PAML (version 4.7 software)[29]被用于分析葡萄WOX基因家族在進(jìn)化過程中受到的選擇壓力。該軟件分析包括6個位點(diǎn)模型分析：M0（one ratio）、M1a（neutral）、M2a（positive selection）、M3（discrete）、M7（beta）以及M8（beta and ω）模型[30]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄WOX家族基因的鑒定與進(jìn)化樹分析

基于葡萄基因組數(shù)據(jù)庫（版本為V2.0）中的蛋白數(shù)據(jù)庫建庫，我們利用之前研究報道的擬南芥中發(fā)現(xiàn)的16個WOX家族基因編碼蛋白序列進(jìn)行BlastP搜索。又通過SMART軟件進(jìn)一步分析搜索到的蛋白序列是否含有完整的Homeobox結(jié)構(gòu)域，從而篩除假陽性蛋白序列。總共在葡萄中鑒定出11種蛋白。參考擬南芥中同源的WOX蛋白進(jìn)行命名，分別命名為VvWUS1，VvWOX1，VvWOX2，VvWOX3，VvWOX4，VvWOX5/7，VvWOX8/9，VvWOX10/14，VvWOX11/12，VvWOX13以及VvWOX15（表1）。其中VvWOX8/9和VvWOX15蛋白來源于同一個基因VIT_210s0003g00560。VvWOX8/9由轉(zhuǎn)錄本VIT_210s0003g00560.1編碼，與擬南芥AtWOX8和AtWOX9的同源性最高，VvWOX15由轉(zhuǎn)錄本VIT_210s0003g00560.2編碼，與擬南芥AtWOX15的同源性最高。因此，實(shí)際上在葡萄中鑒定出10種WOX家族基因。將這10種葡萄WOX家族基因編碼的11種蛋白序列與擬南芥中的16種WOX家族基因編碼的16個蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，每個擬南芥中WOX家族基因都與葡萄中同源性最高的基因關(guān)系更近，同源性最高的葡萄和擬南芥WOX基因編碼的蛋白序列會分到一個小枝中，其編碼基因可推測互為直系同源基因。而全部的WOX蛋白序列可以按照系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分為3個大組。根據(jù)擬南芥中的WOX蛋白編碼基因名稱，發(fā)現(xiàn)這3個組完全對應(yīng)植物WOX家族的現(xiàn)代分支、中間分支以及祖先/基本分支（圖1）。

2.2 葡萄WOX家族基因編碼蛋白保守基序（motif）的分析

利用MEME軟件分析了所有葡萄和擬南芥的WOX蛋白序列。20個保守基序被鑒定（表2）。我們發(fā)現(xiàn)，所有葡萄和擬南芥的WOX蛋白序列都含有motif1和motif2。經(jīng)過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Motif1和motif2兩個結(jié)構(gòu)域的序列包含WOX蛋白的homeobox結(jié)構(gòu)域的序列。除了擬南芥AtWOX15和葡萄VvWOX15，所有中間分支的基因編碼的蛋白都含有motif20。而與VvWOX15同一個基因來源的VvWOX8/9序列含有motif20。葡萄VvWOX15和VvWOX8/9含有2個特有的motif——motif8和motif18。所有祖先/基本分支都含有motif10。除了擬南芥AtWOX5，AtWOX7以及葡萄VvWOX5/7外，其他現(xiàn)代分支的WOX蛋白都含有motif7。而葡萄VvWUS1和擬南芥AtWUS1蛋白所含有的motif并不完全一致，這兩個蛋白都含有motif1，motif2和motif13，然而擬南芥AtWUS1含有3個motif13，葡萄VvWUS1卻只含有1個motif13。

2.3 葡萄WOX家族基因在不同組織中的表達(dá)

圖1 利用葡萄和擬南芥WOX蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Phylogenetic tree based on grape and Arabidopsis WOX proteins

表2 葡萄和擬南芥WOX蛋白的最保守基序序列Table 2 Conserved motif sequences of grape and Arabidopsis WOX proteins

利用前人研究的芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析葡萄WOX家族基因在各個組織中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，VvWOX3在衰老的葉中表達(dá)量最高。VvWUS1在未開的花和花粉中表達(dá)，在花粉中表達(dá)量最高。在其他組織都不表達(dá)。VvWOX13在休眠的冬芽，木質(zhì)部以及根中表達(dá)量較高。VvWOX8/9和VvWOX15的基因在未開的花中表達(dá)量最高，在種子、衰老的葉中表達(dá)量也較高。VvWOX1在幼葉和雌蕊中表達(dá)量較高。VvWOX5/7在成熟的果肉、果皮和衰老的葉中表達(dá)量較高。VvWOX4在新梢和卷須中表達(dá)量較高。VvWOX10/14在新梢和卷須表達(dá)量較高。VvWOX11/12在中度成熟的果皮果肉中表達(dá)量最高（圖2）。而VvWOX2在各個組織中都不表達(dá)。

2.4 葡萄WOX家族基因啟動子的順式作用元件

在線軟件P L A N T C A R E I（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）被用于分析葡萄WOX家族基因的啟動子序列（起始密碼子上游2000bp）。結(jié)果顯示，VvWOX3啟動子含有GCN4_motif（胚乳表達(dá)元件），MRE，MBS（MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件），RY-element（種子表達(dá)元件），Skn-1_motif（胚乳表達(dá)元件），TGA-element（生長素誘導(dǎo)元件）。VvWUS1啟動子含有GARE-motif（赤霉素誘導(dǎo)元件），GCN4_motif，O2-site（玉米素誘導(dǎo)元件），Skn-1_motif。VvWOX13啟動子含有ABRE元件（脫落酸誘導(dǎo)元件），GARE-motif（赤霉素誘導(dǎo)元件），P-box（赤霉素誘導(dǎo)元件），Skn-1_motif。VvWOX8/9和VvWOX15啟動子含有ERE（乙烯誘導(dǎo)元件），GCN4_motif，Skn-1_motif，TATC-box（赤霉素誘導(dǎo)元件）。TGA-element。VvWOX1啟動子含有ABRE，CAT-box（分生組織表達(dá)元件），MRE，MBS，TGA-element。VvWOX5/7含有ERE，GCN4_motif，MBS，Skn-1_motif。VvWOX4含有Skn-1_motif。VvWOX10/14含有AACA_motif （胚乳特異性負(fù)調(diào)控表達(dá)元件），ABRE，ERE，GARE-motif，Skn-1_motif。VvWOX11/12含有AuxRR-core（生長素誘導(dǎo)元件），MBS，Skn-1_motif，TATC-box（赤霉素誘導(dǎo)元件）， TGA-element 和P-box（表3）。

圖2 葡萄WOX家族基因在不同組織中的表達(dá)熱圖Figure 2 The expression of grape WOX family genes in different tissues

表3 葡萄WOX家族基因啟動子含有的順式調(diào)控元件Table 3 The cis-regulated elements of grape WOX family gene promoters

2.5 葡萄WOX家族基因密碼子使用偏好性

用CodonW1.4軟件計算葡萄WOX家族基因的密碼子使用偏好性指數(shù)。計算的密碼子偏好性指數(shù)包括：CBI（密碼子偏愛指數(shù)）、RSCU（密碼子使用相對概率）、CAI（密碼子適應(yīng)指數(shù)）以及Fop（最優(yōu)密碼子使用頻率）。葡萄WOX家族基因外顯子的平均GC含量為48.23%，平均GC3s為47.36%，平均Fop為0.472，平均CAI為0.2177，平均CBI為0.031。而通過分析葡萄WOX家族評價的RSCU發(fā)現(xiàn)，葡萄WOX家族存在密碼子使用的偏好性。例如，編碼酪氨酸（Tyr）密碼子UAC的RSCU值為1.37，而編碼酪氨酸的密碼子UAU的RSCU值為0.63。這說明對于該家族而言，UAC是高頻使用的密碼子，更被偏好使用。而WOX家族中有的氨基酸沒有展示明顯的密碼子偏好性，例如甘氨酸（Gly）的密碼子GGU，GGC和GGA，其RSCU值都是1.05。

為進(jìn)一步揭示葡萄WOX家族基因密碼子使用偏好性及其影響因素，本研究進(jìn)行了葡萄WOX家族基因CAI、CBI以及Fop與外顯子GC含量、外顯子GC3s的相關(guān)性分析，結(jié)果表明，葡萄WOX家族基因的Fop與GC含量著正相關(guān)（r＝0.5，P＜0.01）（圖3A）。葡萄WOX家族基因的CBI與GC含量呈正相關(guān)（r＝0.52，P＜0.01）（圖3B）。葡萄WOX家族基因的CAI與GC含量呈正相關(guān)（r＝0.29，P＜0.01）（圖3C）。葡萄WOX家族基因的Fop與GC3s含量著正相關(guān)（r＝0.53，P＜0.01）（圖3D）。葡萄WOX家族基因的CBI與GC3s含量呈正相關(guān)（r＝0.55，P＜0.01）（圖3E）。葡萄WOX家族基因的CAI與GC3s含量呈正相關(guān)（r＝0.4，P＜0.01）（圖3F）。

2.6 葡萄WOX家族基因受到的選擇壓力

利用Codeml program under PAML軟件中的位點(diǎn)模型去分析各葡萄WOX基因家族在進(jìn)化中所遭受的選擇壓力。當(dāng)該基因家族的Ka/Ksω＝1，說明該基因家族在進(jìn)化中受到中性選擇。當(dāng)基因家族的Ka/Ks(ω)＞1，說明該基因家族受到正向選擇。當(dāng)該基因家族的Ka/Ks(ω)＜1，說明該基因家族受到純化選擇[28]。我們選取了PAML軟件中的M0位點(diǎn)模型來分析WOX基因家族整體受到的選擇壓力。M0模型結(jié)果顯示，葡萄WOX基因家族在進(jìn)化過程中遭遇的是正向選擇（ω＝1.39794）。我們選擇M1、M2、M3、M7與M8位點(diǎn)模型來鑒定正向選擇位點(diǎn)。M1與M2比較結(jié)果顯示，有448個正向選擇位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，其中極顯著位點(diǎn)（P＞99%）包括：104T、172D、173S、179R、208T、236*、305-、349G、353-、354-、355-、360-以及417S。M0與M3模型結(jié)果顯示，有448個正向選擇位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，其中包含極顯著位點(diǎn)（P＞99%）138個。M7與M8比較結(jié)果顯示，有448個正向選擇位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，其中極顯著位點(diǎn)（P＞99%）包括：104T、172D、173S、179R、236*、354-以及355-。

圖3 3種密碼子偏好指數(shù)與GC含量與GC3s的相關(guān)性分析Figure 3 The correlation analysis between three kinds of codons bias index and GC content and GC3s content

3 討論與結(jié)論

本文鑒定了11種WOX家族基因編碼的蛋白。葡萄的WOX基因編碼的蛋白與其他高等植物（如擬南芥）一樣可以被分為現(xiàn)代分支，中間分支以及祖先/基本分支三個大組。通過用MEME軟件分析葡萄WOX蛋白的保守功能motif，發(fā)現(xiàn)了20個保守的motif。每個分支都含有保守的分支特異motif，本結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果一致，并可推測不同的分支功能可能存在分歧[31]。之前的研究顯示，植物WOX家族基因在特定器官和細(xì)胞類型中的表達(dá)暗示其可能在這些特定器官和細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用[8,26]。通過分析葡萄WOX家族基因在各個組織的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)葡萄WOX家族間表達(dá)模式差異較大，部分葡萄WOX家族基因具有組織特異性。例如VvWOX3，其只在葡萄衰老的葉中表達(dá)；VvWOX13只在休眠的冬芽、木質(zhì)部以及根中表達(dá)量較高；VvWOX1只在幼葉和雌蕊中表達(dá)量較高；VvWOX5/7和VvWOX11/12只在成熟的果肉中表達(dá)量最高；VvWOX13只在根中表達(dá)，因此推測可能只有VvWOX13與根的發(fā)育相關(guān)；VvWOX13在木質(zhì)部表達(dá)，其可能與木質(zhì)部的發(fā)育密切相關(guān)。

啟動子順式元件的分析結(jié)果顯示，這些葡萄WOX家族基因的組織特異表達(dá)可能與其啟動子的順式調(diào)控元件相關(guān)。例如，VvWOX8/9和VvWOX15在種子中特異表達(dá)，可能與其啟動子含有Skn-1_motif元件（胚乳特異性表達(dá)元件）相關(guān)。通過表達(dá)分析，推測VvWOX2可能是假基因。在之前對擬南芥WOX家族基因的研究中，也有假基因的發(fā)現(xiàn)[21,26]。通過對葡萄WOX家族基因的密碼子使用偏好性的分析，發(fā)現(xiàn)葡萄WOX家族基因的部分密碼子存在使用偏好性。而葡萄WOX家族基因三種密碼子偏好性指數(shù)（Fop，CBI和CAI）與GC含量/GC3s呈正相關(guān)，表明葡萄WOX家族基因密碼子使用偏好性受突變壓力影響[32-34]。此外，研究發(fā)現(xiàn)葡萄WOX家族在進(jìn)化歷史中主要遭受正向選擇，而大量正向選擇位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)也證實(shí)了這個推論。正向選擇或正向選擇位點(diǎn)可能導(dǎo)致家族成員功能分歧或新功能的出現(xiàn)[32]，這個結(jié)果與保守功能motif的分析結(jié)果相吻合。

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