葡萄砧木品種‘3309M’中microRNA的鑒定

朱旭東，安顏穎，王晨，賈海鋒，房經(jīng)貴*

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/江蘇省果樹品種改良與種苗繁育工程中心，江蘇南京 210095；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇南京 210095）

內(nèi)源小分子RNA（small RNA，sRNA）是一類長度為19～25 nt的非編碼的重要調(diào)節(jié)分子[1]，其通過介導(dǎo)靶基因的裂解或抑制靶翻譯在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[2]。microRNA（miRNA）是非編碼的sRNA主要類型之一，廣泛地分布在生物有機(jī)體內(nèi)，該類sRNA分子在植物的生長發(fā)育及對環(huán)境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中起著重要作用。通常，它們的表達(dá)展示出不同種之間的發(fā)育時(shí)期或組織的特異性。越來越多的研究表明，miRNAs可能參與器官的發(fā)育、細(xì)胞的增殖與分化、細(xì)胞凋亡等重要過程[3]。有關(guān)miRNA的鑒定與其功能分析成為生物研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。隨著具有通量大、時(shí)間短、精確度高和信息量豐富等優(yōu)勢的下一代測序技術(shù)的高速發(fā)展并成為miRNA識別與鑒定的高效技術(shù)[4-5]，葡萄屬植物目前已在歐亞與歐美兩個(gè)種群上開展了高通量測序，大批量的挖掘了葡萄種的miRNA[6-7]。但是，迄今為止，在葡萄砧木上尚無miRNA的相關(guān)研究報(bào)道。

砧木在葡萄種植中的應(yīng)用起源于19世紀(jì)60年代，而隨著葡萄優(yōu)質(zhì)砧木的推廣與應(yīng)用，葡萄嫁接栽培已成為世界各主要葡萄栽培生產(chǎn)國發(fā)展葡萄和葡萄酒產(chǎn)業(yè)的重要舉措[8-9]，并促進(jìn)了葡萄產(chǎn)業(yè)更好地發(fā)展。因此，有關(guān)葡萄砧木生長發(fā)育機(jī)理的研究得到了重視。

葡萄砧木miRNA的研究對砧木抗性機(jī)理的認(rèn)識具有重要意義。為此，本研究首次構(gòu)建了葡萄砧木‘3309M’的miRNA文庫，并通過高通量測序技術(shù)對該miRNA文庫進(jìn)行深度測序，分析了葡萄砧木miRNA文庫的特點(diǎn)，以便于發(fā)現(xiàn)葡萄砧木中參與抗寒、抗病及果實(shí)品質(zhì)發(fā)育的葡萄砧木特異的miRNA，為以后進(jìn)一步分析其功能以及葡萄砧穗互作機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

葡萄砧木‘3309M’（Vitis labrusca）的葉片和根于2016年采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，所有的樣品采集后立即投入液氮帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存，用于總RNA的提取。

1.2 總RNA、sRNA的提取

RNA提取前所有的槍頭、Eppendorf管均用0.1%DEPC水于37 ℃浸泡過夜，高壓滅菌，烘干待用。其他玻璃器皿、研缽等按照分子克隆介紹的方法處理。分別按照如下的方法提取葡萄的葉、莖、卷須、花序、花和果實(shí)等器官的總RNA即按照SDS-酚法提取總RNA，并用4 mol/L的LiCl富集LMW RNA。

sRNA 3'末端加ploy(A)的反應(yīng)總體系為25 μL：1.5μg sRNA模板；5 μL 5×buffer；2.5 μL 25 mmol MgCl2；0.25 μL ATP（100 nM/μL）；1 μL PAP（2 U/μL）；DEPC水補(bǔ)足。置于37 ℃，保溫1 h，得到加ploy(A)尾巴的sRNA。加尾后的小分子RNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，后用適量的DEPC水溶解。

1.3 sRNA cDNA文庫的構(gòu)建和測序

1.3.1 5'端與3'端接頭的連接

將“1.2 總RNA、sRNA的提取”獲得的sRNA與1.3 μL 5'端接頭（5'UCAGAGUUCUACAGUCCGACGA UC）、1 μL 10×T4 RNA連接酶緩沖液、1 μL T4 RNA連接酶、1 μL RNA酶抑制劑混合，于20 ℃反應(yīng)6 h。隨后以15% TBE-Urea PAGE膠進(jìn)行分離純化，將長度為40～60個(gè)核苷酸的條帶切下，粉碎、洗脫、過濾和沉淀。得到的沉淀用無RNA酶的6.4 μL純水溶解后，與0.6 μL 3'端接頭（5'UCGUAUGCCGUCUUCUGCUUGU idT）、1 μL 10×T4 RNA連接酶緩沖液、1 μL T4 RNA連接酶、1 μL RNA酶抑制劑混合，于37 ℃反應(yīng)6 h。連接產(chǎn)物用10% TBE-Urea PAGE膠分離純化：將長度為70個(gè)核苷酸的條帶切下并按前述步驟回收膠內(nèi)的核酸。得到的核酸沉淀用5 μL無RNA酶的DEPC水溶解。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄

將獲得的連有3'端和5'端接頭的sRNA產(chǎn)物用SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將4.5 μL產(chǎn)物與1.5 μL反轉(zhuǎn)錄引物（5'CAAGCAGAAGACGGC ATACGA）混合，于65 ℃加熱10 min去除RNA二級結(jié)構(gòu)，置于冰上。隨后加入2 μL 10×第一鏈緩沖液、1 μL 10mmol/L dNTP、2 μL 100 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）、1 μL RNA酶抑制劑，用DEPC水補(bǔ)至9 μL置于65 ℃溫浴5 min，再加入1 μL SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶，在50 ℃下反應(yīng)1 h。

1.3.3 cDNA文庫的純化和測序

獲得的cDNA用15%的TBE-PAGE膠進(jìn)行分離純化，得到的cDNA用Agilent 2100測定其濃度，最終濃度稀釋到10 nmol/L，用Illumina新一代測序儀1 G Genome Analyzer系統(tǒng)測序平臺進(jìn)行測序。

1.4 miRNA的鑒定

通過Base Callin將原始圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為序列數(shù)據(jù)，即為原始數(shù)據(jù)，并保存在“Fastq”文件中。為獲得高質(zhì)量的序列，從原始序列（raw reads）數(shù)據(jù)中去除接頭序列和質(zhì)量值Q≤5的堿基數(shù)占整個(gè)reads的50%以上的低質(zhì)量序列，將獲得的干凈序列（clean reads）用于數(shù)據(jù)分析。通過比對miRBase 21.0庫中葡萄物種的miRNA序列，得到保守的miRNA。針對miRNA的生物特征，利用Mireap軟件進(jìn)行非保守的miRNA鑒定。

miRNA表達(dá)量采用TPM（transcripts per million）校準(zhǔn)，計(jì)算公式為：miRNA在文庫中的歸一化表達(dá)量=（Read count×106）/Total read count。若2個(gè)文庫中任何1個(gè)miRNA基因的表達(dá)量在歸一化后為0，則被修改為0.01；若2個(gè)文庫中任何1個(gè)miRNA基因的表達(dá)量在歸一化后小于1，則表示其表達(dá)量較低，不宜進(jìn)行差異表達(dá)分析。根據(jù)公式“差異倍數(shù)（foldchange）＝log2（根文庫中miRNA的歸一化表達(dá)量/葉片文庫中miRNA的歸一化表達(dá)量）”計(jì)算根與葉片文庫miRNA表達(dá)的差異倍數(shù)。

1.5 miRNA靶基因的預(yù)測

將測得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫和Rfam10.0數(shù)據(jù)庫中水稻和擬南芥的非編碼RNA進(jìn)行比對，并將sRNA的特異序列（unique reads）與miRBase 21.0數(shù)據(jù)庫中所有植物的序列進(jìn)行BLASTn比對，只有完全匹配的序列才是保守的miRNA。根據(jù)上述分析結(jié)果確定根和葉片文庫中已知的miRNA數(shù)量，對已知的差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行分析，以foldchange≥1且FDR≤0.05作為miRNA顯著差異表達(dá)的篩選條件。

對差異表達(dá)的miRNA利用psRNATarget進(jìn)行靶基因預(yù)測，并使用BLAST軟件將靶基因序列與NR（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、Swiss-Prot（http://www.uniprot.org/）、GO（http://www.geneontology.org/）、COG（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）、KEGG（http://www.kegg.jp/）、KOG（Clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes）、Pfam（http://pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫比對，獲得靶基因的注釋信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄砧木sRNA的測序分析

高通量測序結(jié)果表明：葡萄砧木根和葉片文庫中sRNA的原始序列分別有12 633 906和12 686 708條；去除接頭序列、poly-A序列、≤18 nt序列和低質(zhì)量序列后，干凈序列分別有12 174 719和12 397 993條。在根和葉片文庫中，sRNA的特異序列分別有2 772 037和1 676 324條（表1），其中，能與基因組比對成功的sRNA特異序列分別有949 559和633 100條，分別占各自sRNA特異序列總數(shù)的34.2%和37.8%。

由表1可見，葡萄砧木‘3309M’根和葉片文庫中sRNA類型較多，包括miRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、tRNA和重復(fù)序列。其中，根和葉片文庫中未注釋的sRNA序列分別有1 597 233和1 070 626條，分別占各自sRNA特異序列總數(shù)的57.62%和63.87%，在已注釋的sRNA中，rRNA最多，分別占根和葉片文庫中sRNA特異序列總數(shù)的31.61%和22.67%；其次為tRNA，分別占各自sRNA特異序列總數(shù)的3.53%和2.53%；miRNA較少，分別僅占各自sRNA特異序列總數(shù)的0.47%和0.81%。

2.2 葡萄砧木中保守miRNA的鑒定

為了鑒定葡萄中保守的miRNA，深度測序的小分子RNA序列與目前miRBase 21.0已知的植物保守miRNA的進(jìn)行比對。結(jié)果表明，通過高通量測序鑒定了葡萄砧木根和葉片中文庫分別包含104個(gè)和90個(gè)miRNA家族，共181條miRNA，并且這些鑒定的保守miRNA不同家族成員的數(shù)量存在重要的差異，其中大多數(shù)的家族僅包含幾個(gè)成員，而有4個(gè)家族（miR169、miR395、miR171和miR156）卻分別包含25、13、10和9個(gè)等多個(gè)成員，還有一些家族只有一個(gè)成員如miR162、miR168（圖1）。不同miRNA家族的讀數(shù)（read count）也存在劇烈變化，其變化范圍從1到413 112次（圖2）。在葡萄砧木保守miRNA中，miR159、miR166、miR396和miR482具有最多的讀數(shù)，而另外10條miRNA家族的讀數(shù)很低。這些miRNA表達(dá)豐度的劇烈變化，能夠進(jìn)一步反映出這些miRNA可能在葡萄砧木生長發(fā)育過程中的調(diào)控功能存在重要差異。

表1 葡萄砧木sRNA的組成Table 1 Composition of small RNA in grapevine rootstock

分析葡萄砧木保守miRNA長度的結(jié)果（圖3）可知，長度為21 nt的miRNA所占比例最高，為69.45%；長度為20 nt和22 nt的miRNA所占比例相當(dāng)，為11.63%和12.65%?？傮w上看，在葡萄砧木miRNA中，長度為20～22 nt的miRNA所占比例較高，為93.23%。

圖1 葡萄砧木保守miRNA不同家族的成員數(shù)量Figure 1 Numbers of members of each conserved miRNA families in grapevine rootstock

圖2 葡萄保守miRNA不同家族成員的讀數(shù)Figure 2 Numbers of identified miRNAs in each conserved miRNAs family in grapevine rootstock

對葡萄砧木保守miRNA堿基偏好性進(jìn)行分析（圖4），結(jié)果表明，保守miRNA的第一個(gè)堿基偏好U，比例達(dá)到71%，說明該測序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。

2.3 葡萄砧木中miRNA靶基因功能的預(yù)測

充分認(rèn)識miRNA的靶基因?qū)⒂兄谖覀兩钊肜斫鈓iRNA調(diào)控基因的范圍以及更廣泛地描述這些miRNA功能的重要性。本研究根據(jù)miRNA與其靶基因之間近乎完全或完全的互補(bǔ)性以及一些靶基因預(yù)測的標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測了25個(gè)miRNA家族總共412個(gè)靶基因。將預(yù)測到的412個(gè)葡萄砧木根和葉片中miRNA的靶基因分別在Swiss-Prot、GO、KEGG、COG、KOG、Pfam和NR數(shù)據(jù)中進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)分別有354、147、95、190、248、373和412個(gè)靶基因得到注釋。

圖3 保守miRNA的長度分布圖Figure 3 Size distributions of conserved miRNA sequences from grapevine rootstock

圖4 miRNA各位點(diǎn)堿基分布圖Figure 4 The bias distribution of nucleotide base in each position of miRNA sequences

圖5 葡萄砧木中鑒定的保守miRNA靶基因的GO功能分類結(jié)果Figure 5 GO classification of conserved miRNA target genes identified in grapevine rootstock

利用GO功能分類對葡萄砧木根和葉片鑒定的保守miRNA靶基因進(jìn)行功能預(yù)測（圖5），結(jié)果表明：大部分差異表達(dá)miRNA靶基因的功能主要集中在生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能3方面。細(xì)胞組分中，細(xì)胞、細(xì)胞部分和細(xì)胞器中的差異表達(dá)miRNA靶基因較多；在分子功能中，多數(shù)差異表達(dá)miRNA靶基因與結(jié)合功能及催化活性有關(guān)，與核苷酸結(jié)合有關(guān)的miRNA靶基因最多；在生物過程中，差異表達(dá)miRNA靶基因的功能主要集中在代謝過程（Metabolic process）、細(xì)胞過程（Cellular process）、單一生物過程（Single-organism process）、生物調(diào)節(jié)（ Biological regulation）、響應(yīng)刺激（Response to stimulus）等。

對葡萄砧木根和葉片中鑒定的保守miRNA靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析（圖6）。結(jié)果顯示：富集差異表達(dá)miRNA靶基因數(shù)量最多的通路依次為核糖體（Ribosome）、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Plant hormone signal transduction）、氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、RNA運(yùn)輸（RNA transport）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)（Protein processing in endoplasmic reticulum）、糖酵解/糖異生（Glycolysis/Gluconeogenesis）等，富集的差異表達(dá)miRNA靶基因數(shù)分別為206、199、181、161、153和145個(gè)。

圖6 葡萄砧木中鑒定的保守miRNA靶基因的KEGG通路富集分析的結(jié)果Figure 6 KEGG enrichment analysis of conserved miRNA target genes identified in grapevine rootstocks

依據(jù)同源基因的功能注釋，我們把這些靶基因分為三大類：最大的一類是轉(zhuǎn)錄因子，其參與植物的生長、發(fā)育以及由營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)型；第二大類是編碼不同的酶蛋白基因，其主要涉及在不同的代謝過程如ATP、sulfurylase/APS kinase、ATP synthase等；第三類與免疫反應(yīng)（NLA）、脅迫反應(yīng)（CWP3）、抗病反應(yīng)（NBSLRR）以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（ARF、AFB）等過程相關(guān)。大多數(shù)潛在的靶基因預(yù)測的功能與蘿卜[10]、枳[11]、番茄[12]和擬南芥[13]等植物上鑒定的功能基本一致，表明不同植物中的靶基因的功能具有較高的保守性。

2.4 葡萄砧木根和葉片中顯著差異表達(dá)miRNA的篩選

進(jìn)一步的分析結(jié)果（表2）表明：以foldchange≥1且FDR≤0.05作為篩選條件，確定顯著差異表達(dá)的miRNA家族有32個(gè)，共87條miRNA家族成員，其中54條miRNA在葉片文庫上調(diào)表達(dá)（分別屬于vvimiR167a、vvi-miR156f、vvimiR156i、vvi-miR156g、vvimiR172d等成員），33條miRNA下調(diào)表達(dá)。

2.5 葡萄砧木中新的miRNA的鑒定

表2 葡萄砧木根和葉片中顯著差異表達(dá)miRNA的表達(dá)特性分析Table 2 Analysis on the expression of miRNA in grape rootstocks roots and leaves

續(xù)表2 Continued table 2

針對miRNA的生物特征，對于比對到參考基因組的序列，利用Mireap軟件進(jìn)行非保守的miRNA鑒定。測序序列比對到參考序列，通過堿基數(shù)目延伸，獲得潛在前體序列，對前體序列進(jìn)行miRNA結(jié)構(gòu)預(yù)測，獲得新的非保守的miRNA。本研究發(fā)現(xiàn)了104條新的miRNA，其前體均能夠被折疊成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。在這些新的miRNA中，有32條新的miRNA的5'末端以U開頭，而另外53條miRNA的5'末端以A開頭（在雙鏈RNA中A互補(bǔ)于U），這些是miRNA序列結(jié)構(gòu)的重要特征。所有這些分析結(jié)果有力地證明了葡萄砧木中新的miRNAs的真實(shí)性。

研究發(fā)現(xiàn)，新的非保守的miRNAs被測序到的讀數(shù)（rea count）通常比保守的miRNA的數(shù)量要少，只有25條miRNA的序列的讀數(shù)達(dá)到10次（表3）。這些結(jié)果與山葡萄和鮮食葡萄中的研究報(bào)道相一致[14-16]，大多數(shù)新的特異的miRNA通常比保守miRNA的表達(dá)水平低，且具有時(shí)空的特異性。基因組定位分析表明，這些新的miRNA均定位在葡萄第10、11、12和13條染色體，分別有24、22、26和32條miRNA，可以看出其在染色體上的分布是不均勻的。

3 討論和結(jié)論

3.1 葡萄砧木保守miRNA的鑒定

大多數(shù)成熟的miRNA在不同植物中具有較高的保守性[1,3]。這能為預(yù)測不同植物中的同源miRNA提供有力證據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)山葡萄與野生葡萄等不同品種中保守的和新的miRNA的數(shù)量與種類具有顯著差異[14-16]，表明葡萄的不同品種、不同組織中miRNA文庫存在自身特點(diǎn)，有必要在不同葡萄種質(zhì)的不同組織中開展高通量測序，以便能夠發(fā)現(xiàn)更多種類和數(shù)量的miRNA。

表3 葡萄砧木中鑒定的新的miRNATable 3 Novel miRNA identified in grapevine rootstock

本研究構(gòu)建了葡萄砧木品種‘3309M’根和葉組織的小RNA文庫，鑒定了181條保守的和104條非保守的miRNA。葡萄砧木根和葉片中共有32個(gè)miRNA家族共87條顯著差異表達(dá)，其中vvi-miR167a、vvi-miR166b、vvimiR162和vvi-miR156等54條miRNA上調(diào)表達(dá)，其余33條miRNA下調(diào)表達(dá)。不同植物中的miRNA存在一定差異。本研究中，葡萄砧木根和葉片中miRNA長度均以21 nt為主。相關(guān)研究結(jié)果顯示，蘿卜中的miRNA長度以21 nt和24 nt為主[10]；枳和番茄的miRNA長度以21 nt為最多[11-12]，而擬南芥中的miRNA長度則以24 nt為最多[13]，但與鮮食和野生葡萄中miRNA的長度分布一樣[14-16]，表明不同植物的miRNA長度存在差異，可能與植物種類及參與miRNA生物合成的酶不同有關(guān)。

3.2 葡萄砧木保守miRNA的靶基因

為了鑒定植物miRNA的功能，進(jìn)一步確定其靶基因非常必要。目前，植物上靶基因預(yù)測最有效的工具是基于miRNA與靶基因高度同源性的生物信息學(xué)預(yù)測方法。本研究利用生物信息學(xué)方法預(yù)測了葡萄砧木中保守miRNA的靶基因，發(fā)現(xiàn)預(yù)測的大多數(shù)靶基因是植物特異的轉(zhuǎn)錄因子，如AP2、NAC、SBP、NF-YA、GRAS、Zincnger（C2H2）和ARF等，與鮮食葡萄和野生葡萄中miRNA靶基因類似，表明miRNA功能的保守性。本研究中，葡萄砧木根和葉片中miRNA靶基因的功能主要集中在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化磷酸化、RNA運(yùn)輸、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)運(yùn)輸、糖酵解/糖異生等方面，這可能與葡萄砧木的抗性較強(qiáng)有關(guān)。葡萄砧木miRNA的靶基因功能注釋表明它們在葡萄的生長、發(fā)育及對環(huán)境脅迫反應(yīng)的應(yīng)答過程中起著重要作用，開展進(jìn)一步的研究有助于更廣泛地理解miRNA在葡萄砧木生長發(fā)育中的功能。

3.3 葡萄砧木中新的miRNA的預(yù)測

本研究根據(jù)miRNA的特征如前體典型的發(fā)夾結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，共預(yù)測了104條非保守的新的miRNA。所有這104條新的miRNA的前體都能夠折疊成典型的發(fā)夾結(jié)構(gòu)并滿足miRNA的預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)。只有25條新的miRNA的讀數(shù)達(dá)到10次以上。所有這些結(jié)果證明，這104條新的miRNA在葡萄砧木中確實(shí)存在。新的miRNA在葡萄砧木特定組織的特異表達(dá)能夠?yàn)檠芯克鼈兊纳砉δ芴峁┲匾畔?。葡萄砧木特異的miRNA在其生長發(fā)育過程中的詳細(xì)功能仍有待我們?nèi)嫔钊氲仃U述。

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