群多普利對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究

周剛，王佳君

腦缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，最近研究發(fā)現(xiàn)，腦血流中斷和再灌注使腦的細(xì)胞產(chǎn)生損傷是一個(gè)快速的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)包括許多環(huán)節(jié)，如能量障礙、細(xì)型，上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠；BI-2000圖像分析系統(tǒng)：成都泰盟科技有限公司；酶標(biāo)儀：Genios TECAN公司，奧地利。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組及給藥 將健康雄性SD大鼠隨機(jī)分成模型組、假手術(shù)組、群多普利低劑量組（5 mg/kg）、群多普利高劑量組（10 mg/kg），12只/組；腹腔注射給藥，模型組、假手術(shù)組給予同劑量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥6 d。第6天給藥后1 h建立缺血再灌注模型。

1.4.2 腦缺血/再灌注動(dòng)物模型的制備 采用改良ZeaLonga's法制作大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MACO）模型[2]。大鼠用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸部正中線切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣鈍性分離肌肉和筋膜，直到分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端及頸總動(dòng)脈，然后在距頸總動(dòng)脈近分叉3～4 mm處剪口，按體重選取適當(dāng)直徑自制線栓（參照范圍：180～230 g：0.235 mm；230～260 g：0.26 mm；＞260 g：0.28 mm）自切口輕輕插入，插入深度（從頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處計(jì)起）約為18～20 mm，固定魚(yú)線，縫合皮膚。缺血2 h后，將栓塞線向外輕輕拔出10 mm左右，抽拉出至頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉進(jìn)行復(fù)灌。假手術(shù)組按上述方法，分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈后，插入栓塞線僅至頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處，而不阻塞大腦中動(dòng)脈。復(fù)灌24 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.3 模型的鑒定 模型制備過(guò)程中，應(yīng)用SA5600自動(dòng)血流變儀檢測(cè)大鼠大腦中動(dòng)脈血流改變；如圖1所示，大鼠MCAO模型可顯著減少大腦中動(dòng)脈血流量；復(fù)灌后，大腦中動(dòng)脈血流量基本恢復(fù)；大鼠清醒后，觀察MCAO后的神經(jīng)行為特征的變化，即出現(xiàn)下面體征者表明模型制作成功[2]：①大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞側(cè)（本實(shí)驗(yàn)栓塞右側(cè)）出現(xiàn)Horner征，表現(xiàn)為瞳孔縮小，眼裂變小。②軀體向?qū)?cè)屈曲，大鼠不能充胞酸中毒、興奮性氨基酸釋放增加、細(xì)胞內(nèi)鈣失穩(wěn)態(tài)、自由基生成、凋亡基因激活等。這些環(huán)節(jié)互為因果，彼此重疊，并相互聯(lián)系，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死[1]。近年來(lái)研究表明，炎癥在腦缺血再灌注損傷中起著重要作用，腦缺血再灌注后內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)使血腦屏障受損，加重了腦損害及腦水腫。近期研究表明，腎素-血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）類藥物具有抗炎[2]、抑制組織纖維素樣壞死、抑制金屬基質(zhì)蛋白酶（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）的活性等藥理作用[3]，因此研究抑制腦缺血后炎癥反應(yīng)，可能成為治療腦缺血損傷的有效方法。本實(shí)驗(yàn)采用大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，探究群多普利對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其對(duì)炎癥反應(yīng)相關(guān)因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-10表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康SD大鼠48只，體重220～260 g，購(gòu)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（鄂）2010-0007。大鼠自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均符合華中科技大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)有關(guān)條例規(guī)定。

1.2 藥品與試劑 群多普利購(gòu)自美國(guó)的USP對(duì)照品（批號(hào)：FOH140），2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；IL-1β及IL-10免疫酶聯(lián)吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 SA5600自動(dòng)血流變儀：北京賽科西德公司；pH計(jì)：DELTA320，梅特勒（上海）有限公司；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)：TGL-16A，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表公司；恒溫水槽：SSW分伸展左前肢，提尾時(shí)軀體向左轉(zhuǎn)，右側(cè)前后肢外展，左側(cè)前后肢松軟屈曲。③運(yùn)動(dòng)時(shí)出現(xiàn)追尾征：運(yùn)動(dòng)時(shí)軀體向一側(cè)傾斜、旋轉(zhuǎn)。假手術(shù)組會(huì)出現(xiàn)Horner征，但無(wú)左前肢屈曲和追尾征。④缺血腦組織切片，TTC染色，可見(jiàn)蒼白色的缺血區(qū)域。

1.4.4 神經(jīng)癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 大鼠清醒后，觀察其行為學(xué)變化，神經(jīng)癥狀按Longa 5分制評(píng)分[2]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)神經(jīng)損傷，0分；不能完全伸展左側(cè)肢體，前肢為甚，1分；向左轉(zhuǎn)圈，2分；行走時(shí)向左側(cè)傾倒，3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)昏迷，4分。分?jǐn)?shù)越高，表示動(dòng)物神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。

1.4.5 TTC染色及腦梗死體積的測(cè)定 大鼠MCAO 2 h再灌注24 h后，迅速斷頭取腦，沿冠狀面切成6片（每片約2 mm），立即置于2%TTC磷酸鹽緩沖液中，37℃避光溫浴30 min。取出腦片置10%福爾馬林液中固定，正常腦組織為玫瑰紅色，梗死部位為白色。應(yīng)用BI-2000圖像分析系統(tǒng)分析計(jì)算腦梗死體積占全腦體積的百分比。

1.4.6 ELISA檢測(cè)腦組織IL-1β及IL-10含量 大鼠MCAO 2 h再灌注24 h后，迅速斷頭取腦，立即置于冰盤上，取梗死交界區(qū)腦組織，用冰凍生理鹽水制備20%腦勻漿，2500 r/min離心10 min，取上清，-80℃保存用于IL-1β及IL-10含量的測(cè)定，具體操作步驟按IL-1β及IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，各因子含量以每克蛋白所含細(xì)胞因子皮克數(shù)表示，即pg/g（pro）[4-5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)以表示，多組資料采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 群多普利對(duì)缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響 缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能評(píng)分為（2.67±0.21）分；群多普利低劑量和高劑量組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分分別降至（1.75±0.25）分（P＜0.05）及（1.60±0.39）分（P＜0.05）（表1）。

2.2 群多普利對(duì)缺血再灌注損傷大鼠腦梗死體積的影響 群多普利低劑量和高劑量均可顯著降低大鼠腦梗死體積百分比（表2和圖2）。

2.3 群多普利對(duì)缺血再灌注損傷大鼠腦組織IL-1β及IL-10含量的影響 缺血再灌注損傷大鼠腦梗死交界區(qū)腦組織的IL-1β及IL-10含量分別為（6.77±0.94）pg/g（pro）及（8.68±0.78）pg/g（pro）；群多普利低劑量組和高劑量組大鼠腦組織IL-1β的含量分別下降至（4.53±1.06）pg/g（pro）（P＜0.05）及（4.01±0.89）pg/g（pro）（P＜0.01）；群多普利高劑量使大鼠腦組織IL-10的含量增加至（12.83±0.92）pg/g（pro）（P＜0.05）。

圖1 大鼠缺血前后及再灌注后大腦中動(dòng)脈血流改變

表1 各組大鼠神經(jīng)神經(jīng)功能損傷評(píng)分及腦梗死體積

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，群多普利可顯著減小大鼠腦缺血再灌注損傷所致的腦梗死體積，改善神經(jīng)功能預(yù)后。

缺血再灌注損傷涉及極其復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其中各個(gè)環(huán)節(jié)、各種影響因素間的相互作用尚未完全闡明。目前認(rèn)為，其主要機(jī)制包含興奮性氨基酸毒性、自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化、線粒體功能障礙、Ca2+超載及由上述因素引起的一系列致炎因子（IL-1、腫瘤壞死因子-α、IL-6等）和抗炎癥因子（IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等）表達(dá)失衡。上述各環(huán)節(jié)可以相互影響，相互促進(jìn)，導(dǎo)致病情的進(jìn)一步惡化。腦缺血損傷的最終發(fā)展方向主要是炎癥反應(yīng)引起的細(xì)胞壞死和凋亡。因此，控制腦缺血過(guò)程中的炎癥反應(yīng)，阻斷惡性循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)改善腦缺血癥狀及預(yù)后有重要意義。

表2 群多普利對(duì)缺血再灌注損傷大鼠腦組織IL-1β及IL-10含量的影響

圖2 群多普利對(duì)缺血再灌注損傷大鼠腦梗死體積的影響

IL-1β為一種致炎細(xì)胞因子，廣泛參與了人體組織破壞、水腫形成等多種病理?yè)p傷過(guò)程。研究表明，IL-1β可加重腦缺血引起的腦水腫及中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)[6]，IL-1β受體拮抗劑IL-1RA可減少M(fèi)CAO大鼠腦梗死[7]；在腦缺血損傷的炎癥反應(yīng)中，效應(yīng)細(xì)胞在產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子的同時(shí)，也會(huì)合成分泌大量的抑炎細(xì)胞因子，兩者之間互相作用，決定著炎癥反應(yīng)的發(fā)展方向。IL-10是Th2型細(xì)胞因子中最重要的抗炎細(xì)胞因子，在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著極其重要的作用，其可下調(diào)主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅱ型抗原、共刺激分子B7和黏附分子的表達(dá)，抑制抗原的遞呈過(guò)程，直接抑制T細(xì)胞的增殖；此外，IL-10能抑制炎癥細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子-α及一氧化氮、自由基、前列腺素等炎性調(diào)節(jié)因子的分泌，進(jìn)而保護(hù)宿主免受過(guò)度的免疫及炎癥反應(yīng)。已有研究表明，IL-10可顯著減少大腦中動(dòng)脈急性閉塞所致的腦梗死的體積[8]。

研究表明，在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中血管緊張素Ⅱ作為一個(gè)致炎因子發(fā)揮著重要作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，短暫性全腦缺血后及給予血管緊張素Ⅱ可增加腦水腫程度[9]，給予血管緊張素受體阻滯劑或血管緊張素Ⅱ抗體可以顯著減少腦梗死面積、提高神經(jīng)功能預(yù)后[10-12]，然而，其具體機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷大鼠腦組織內(nèi)IL-1β及IL-10含量均顯著增加，IL-1β的增加提示缺血再灌注損傷可誘發(fā)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷；IL-10的增加提示可能存在一種內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制；顯而易見(jiàn)，此時(shí)的致炎因子與抗炎因子處于失衡狀態(tài)；給予5 mg/kg及10 mg/kg群多普利均可明顯改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分，減少腦梗死體積，同時(shí)抑制IL-1β的分泌，高劑量的群多普利（10 mg/kg）可進(jìn)一步提高IL-10的分泌。上述結(jié)果提示，低劑量的群多普利主要是抑制炎癥因子IL-1β的分泌，而較高劑量時(shí)既可抑制炎癥因子IL-1β的分泌，又可增加抗炎因子IL-10的分泌。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步提示，在腦缺血再灌注損傷雄性大鼠中，群多普利可能通過(guò)調(diào)節(jié)IL-1β及IL-10的分泌，重建促炎因子與抗炎因子之間的平衡，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。但是本實(shí)驗(yàn)尚存在一定的局限性：①為了排除雌激素對(duì)腦缺血的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)僅選取雄性大鼠為研究對(duì)象；②有關(guān)群多普利對(duì)炎性因子的調(diào)控機(jī)制尚有待進(jìn)一步探究。

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