氣相色譜—質(zhì)譜法用于人尿中4種二羧酸的含量檢測(cè)

馬振菁　黃建明　林綏

[摘要] 目的 建立測(cè)定人尿中有機(jī)酸二羧酸類(lèi)含量分析方法。 方法 采用離子轟擊（EI）離子源質(zhì)譜檢測(cè)尿中二羧酸含量。尿液樣品前處理：采用內(nèi)標(biāo)法，樣品先進(jìn)行α-酮肟反應(yīng)，再硫酸甲醇溶液進(jìn)行甲酯化處理，氯仿萃取有機(jī)二羧酸。 結(jié)果 線粒體肌病組辛二酸含量均低于正常組和重癥肌無(wú)力組（P < 0.05）；線粒體肌病組和重癥肌無(wú)力組庚二酸含量均明顯低于正常組（P < 0.05）。精密度日內(nèi)RSD為1.00%～2.84%，日間RSD為2.01%～3.87%，加標(biāo)平均回收率為88.47%～104.09%，RSD為1.24%～4.19%。 結(jié)論 氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定尿液二羧酸類(lèi)有機(jī)酸化合物方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于幫助臨床篩查肉堿循環(huán)酶缺陷遺傳代謝病。

[關(guān)鍵詞] 二羧酸；氣相色譜-質(zhì)譜法；線粒體肌??；重癥肌無(wú)力；尿液

[中圖分類(lèi)號(hào)] R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）03（c）-0097-04

[Abstract] Objective To establish an analytical method for the determination of organic acids dicarboxylic acid in human urine. Methods The content of dicarboxylic acid in the urine was detected by ion bombardment （EI） ion source mass spectrometry. Urine sample pretreatment： by using internal standard method， the sample was taken α-ketoxime reaction first， and then sulfuric acid methanol solution was carried out the process of methyl esterification， chloroform was used for extraction of organic dicarboxylic acid. Results The content of suberic acid in mitochondrial myopathy group was lower than that in normal group and myasthenia gravis group （P < 0.05）. The concentration of pimelic acid in mitochondrial myopathy group and myasthenia gravis group were significantly lower than those in normal group （P < 0.05）. The intra-day RSD was 1.00%-2.84%， and the inter-day RSD was 2.01%-3.87%. The average recovery rate of the added standard was 88.47%-104.09%， and RSD was 1.24%-4.19%. Conclusion The method of gas chromatography-mass spectrometry for determination of urinary dicarboxylic acid organic acid compounds is simple， accurate， with good reproducibility， which can be used to help screening carnitine circulating enzyme deficiency inherited metabolic diseases in clinic.

[Key words] Dicarboxylic acid； Gas chromatography-mass spectrometry； Mitochondrial myopathy； Myasthenia gravis； Urine

隨著1966年K-Tanak首先將氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS）聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于遺傳代謝病檢測(cè)后，已在歐美等國(guó)家得到廣泛應(yīng)用，尿液中有機(jī)酸的異常升高或異常有機(jī)酸的出現(xiàn)，往往與體內(nèi)這些化合物代謝的紊亂有關(guān)，其中某些有機(jī)酸異常的變化可為遺傳代謝性疾病[1-4]，在遺傳代謝病中肉堿循環(huán)酶缺陷影響長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)，以尿中無(wú)二羧酸類(lèi)代謝物為其特征，因此準(zhǔn)確檢測(cè)尿液中二羧酸類(lèi)有機(jī)酸含量，對(duì)于幫助遺傳代謝病篩查診斷具有重要應(yīng)用價(jià)值。

尿液樣品的前處理有有機(jī)酸萃取法和尿素酶法，前者主要應(yīng)用于歐美國(guó)家，使用年限較長(zhǎng)，后者是近幾年由日本學(xué)者建立，經(jīng)尿素酶處理后，不經(jīng)有機(jī)溶劑萃取直接進(jìn)行GC/MS分析，但未經(jīng)有機(jī)溶劑萃取的氣相色譜圖的雜峰甚多，不利結(jié)果分析，且無(wú)法定量檢測(cè)到脂肪二羧酸類(lèi)代謝物，本研究是對(duì)尿液前處理進(jìn)行改進(jìn)，使得有機(jī)二羧酸類(lèi)化合物提取與甲酯化在一個(gè)體系同步進(jìn)行，采用GC/MS聯(lián)用方法測(cè)定樣本中己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸的含量，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 樣品來(lái)源

45名健康人（正常組）來(lái)自福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院職工和福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)生，其中男21名，女24名，年齡20～60歲。無(wú)低血糖病史，無(wú)肝、腎、腦疾病病史，無(wú)嚴(yán)重感染病史，無(wú)代謝性疾病病史，無(wú)心電圖和腦電圖異常。6例線粒體肌病患者（線粒體肌病組）為2013年6月～2017年3月福建省附屬第一醫(yī)院的患者，經(jīng)過(guò)基因檢測(cè)確診，其中男3例，女3例，年齡9～48歲。重癥肌無(wú)力12例患者（重癥肌無(wú)力組）為福建省立醫(yī)院2016年6月～2017年6月的就診患者，其中男9例，女3例，年齡21～64歲。遵循程序符合人體試驗(yàn)委員會(huì)制訂的倫理標(biāo)準(zhǔn)，獲得研究對(duì)象同意，自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 儀器與試劑

Agilent 7890A/5975氣相色譜-質(zhì)譜儀，配有電子轟擊（EI）離子源及化學(xué)工作站（美國(guó)Agilent公司）。對(duì)照品己二酸（批號(hào)：J126G005）、辛二酸（批號(hào)：F039G005）、壬二酸（批號(hào)：P1168205）由CNW提供；庚二酸（瑞士Adamas-beta公司，批號(hào)：P1011072）；正十七酸（Sigma公司，批號(hào)：044K1647）；鹽酸羥胺（Fluka公司，批號(hào)：LJ0118B0810J）；甲醇為色譜純，濃硫酸為分析純，氯仿為分析純經(jīng)重蒸餾處理，水為超純水。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

Hp-5ms（30 m×0.25 mm，0.25 μm）色譜柱，程序升溫：初始40℃保持3 min，以8℃/min升溫至290℃，保持3 min；以氦氣為載氣，流速為1.0 mL/min恒流，采用不分流進(jìn)樣，1 min開(kāi)閥，進(jìn)樣口溫度：260℃，傳輸線：290℃，采用EI離子源質(zhì)譜檢測(cè)；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；掃描范圍：m/z 50～550，掃描方式：全掃描和選擇離子掃描（SIM），溶劑延遲3.0 min。

1.4 樣品前處理方法

晨尿經(jīng)過(guò)2200 g離心8 min，取尿液上清液分裝于凍存管中至-20℃保存直至開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)供試樣品從冰箱中取出，在室溫下解凍，尿樣品以3400 r/min（2200 g）離心5 min，取上清1 mL于10 mL離心管中，加入100 μL內(nèi)標(biāo)（568.4 mg/mL正十七烷酸），搖勻，再加入100 μL 2.5%鹽酸羥胺和300 μL 10 mol/L氫氧化鈉溶液，蓋緊充分混勻，靜止1 h。在反應(yīng)體系里加入130 μL 50%硫酸酸化混勻，再2 mL 10%硫酸-甲醇液進(jìn)行甲酯化反應(yīng)，漩渦振蕩1 min，樣品置60℃水浴反應(yīng)90 min。取出樣品放至室溫，加入1 mL超純水，混勻，用2 mL氯仿提取有機(jī)酸甲酯，漩渦振蕩2 min，2200 g離心8 min，取下層溶液經(jīng)微孔有機(jī)濾膜過(guò)濾置樣品瓶中，作為供試品溶液。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限考察

準(zhǔn)確稱(chēng)取辛二酸、庚二酸、己二酸、壬二酸對(duì)照品10.0 mg，用甲醇溶液配制成1.0 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液；儲(chǔ)備液經(jīng)過(guò)超純水不同程度稀釋后得到的不同濃度的對(duì)照品混合液按“1.4”項(xiàng)方法處理，在已優(yōu)化的條件下做工作曲線，測(cè)定結(jié)果以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)，以其濃度（x）為橫坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸，得回歸方程如表1所示，線性相關(guān)系數(shù)為0.991～0.998，線性關(guān)系良好。尿液中4種有二羧酸有機(jī)酸結(jié)果見(jiàn)表1，加對(duì)照品混合液尿液總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

在已知濃度的健康者混合尿樣中分別加入1.0、10.0 μg/mL 2個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.4”項(xiàng)進(jìn)行樣品前處理，并照上述質(zhì)譜條件進(jìn)行分析。每個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液平行分析4次，分別計(jì)算每種濃度的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n = 4）（RSD）為1.00%～2.84%，每個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制成5份，每天分析1份，計(jì)算不同濃度的日間RSD為2.01%～3.87%，計(jì)算2種濃度的加標(biāo)回收率分別為88.47%～98.01%，RSD為1.59%～3.34%；96.31%～104.09%，RSD為1.24%～4.19%。見(jiàn)表3。

2.4 樣品分析

應(yīng)用本方法測(cè)定了45名健康人、6例線粒體肌病和12例重癥肌無(wú)力患者的尿液中4種二羧酸類(lèi)有機(jī)酸含量，結(jié)果見(jiàn)表4。線粒體肌病組辛二酸含量均低于正常組和重癥肌無(wú)力組（P < 0.05），線粒體肌病組和重癥肌無(wú)力組庚二酸含量均明顯低于正常組（P < 0.05）。

3 討論

近年來(lái)尿有機(jī)酸代謝已經(jīng)引起廣泛關(guān)注，研究成果與日俱增[5-11]，為了探討尿有機(jī)酸代謝產(chǎn)物在疾病病因?qū)W上的作用，本研究采用GC/MS技術(shù)對(duì)線粒體肌病和重癥肌無(wú)力尿樣本進(jìn)行有機(jī)酸二羧酸含量分析，采用單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)三組二羧酸含量有明顯差異，不考慮體重因素影響，疾病組庚二酸含量均明顯低于正常組（P < 0.05），線粒體肌病組辛二酸含量均低于正常組和重癥肌無(wú)力組（P < 0.05），如果把體重因素加入，線粒體肌病組辛二酸含量?jī)H低于正常組，說(shuō)明體重也會(huì)影響二羧酸類(lèi)代謝；從健康人的測(cè)定結(jié)果可以看出壬二酸的含量女的比男的高些，總的二羧酸類(lèi)含量男女有一些差別，但都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能跟樣本數(shù)量有關(guān)。

基于質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，分析常用樣品衍生化方法為硅烷化，此法衍生化物質(zhì)范圍廣，但由于硅烷化試劑遇水立即分解，因此樣品衍生化前需用氮?dú)獯蹈桑粐?guó)內(nèi)對(duì)于有機(jī)酸衍生化這塊還局限于甲基硅烷化[12-13]，而甲基硅烷化對(duì)反應(yīng)樣品的要求是無(wú)水狀態(tài)，這對(duì)提取的有機(jī)酸要求增高，成本增加，必須樣品要氮?dú)獯蹈桑瑫r(shí)樣品經(jīng)過(guò)多次的萃取增加了操作的復(fù)雜程度，也造成損失。

在本研究中經(jīng)過(guò)系列的實(shí)驗(yàn)選擇100 μL 2.5%鹽酸羥胺和300 μL 10 mol/L氫氧化鈉溶液進(jìn)行α-酮肟反應(yīng)，此濃度搭配才能使反應(yīng)進(jìn)行完全，反應(yīng)終止時(shí)間是1 h，已經(jīng)達(dá)到了反應(yīng)平臺(tái)期，采用130 μL 50%硫酸是正好用來(lái)終止反應(yīng)液中多余的堿量。日本學(xué)者應(yīng)用濾紙收集尿標(biāo)本，經(jīng)尿素酶處理后，不經(jīng)有機(jī)溶劑萃取直接進(jìn)行GC/MS分析，用于遺傳代謝性疾病新生兒群體篩查[14]，但未經(jīng)有機(jī)溶劑萃取的氣相色譜圖的雜峰甚多，不利結(jié)果分析，且甚易污染氣相色譜柱和質(zhì)譜離子源，尿液有機(jī)酸萃取預(yù)處理法對(duì)各種特異性代謝產(chǎn)物的檢出量高于尿素酶預(yù)處理法，對(duì)于后者無(wú)法檢測(cè)到的脂肪二羧酸有機(jī)酸萃取預(yù)處理法仍能檢測(cè)出。遺傳代謝病肉堿循環(huán)酶缺陷影響長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)，以尿中無(wú)二羧酸為其特征，檢索了國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)有其他文獻(xiàn)報(bào)道在一個(gè)反應(yīng)體系里對(duì)尿液有機(jī)酸脂肪酸萃取并甲酯化同步進(jìn)行的報(bào)道，本研究是基于逼著作者原有GC測(cè)定血液游離脂肪酸的方法[15-16]基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，減少了反復(fù)萃取的樣品損失，在一個(gè)體系里直接對(duì)尿液中有機(jī)酸脂肪酸進(jìn)行甲脂化后并萃取，考慮到主要用于有機(jī)酸二羧酸類(lèi)分析，采用容易控制并不懼水的甲酯化反應(yīng)，并具有操作簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確度和精密度高等優(yōu)點(diǎn)。本方法適用于幫助臨床遺傳代謝病中肉堿循環(huán)酶缺陷篩查診斷和預(yù)防醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域生物樣本中二羧酸類(lèi)有機(jī)酸檢測(cè)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 韓連書(shū)，葉軍，邱文娟，等.血尿琥珀酰丙酮檢測(cè)在酪氨酸血癥-Ⅰ型診斷中的應(yīng)用[J].中華兒科雜志，2012，50（2）：126-130.

[2] 韓連書(shū)，毋盛楠，葉軍，等.單純型甲基丙二酸血癥患者診治分析[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2013，30（5）：589-593.

[3] 江敏妍，劉麗，李秀珍，等.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在3-羥基-3-甲基戊二酸尿癥診斷中的應(yīng)用[J].實(shí)用兒科臨床雜志，2012，27（20）：1557-1560.

[4] 楊楠，韓連書(shū)，葉軍，等.楓糖尿病患者臨床表現(xiàn)及質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果分析[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2012，92（40）：2839-2842.

[5] 張萬(wàn)巧，彭薇，楊堯，等.氣相色譜質(zhì)譜法篩查先天性代謝缺陷方法及診斷標(biāo)準(zhǔn)的建立[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志，2015，29（11）：1059-1062.

[6] 楊楠，韓連書(shū)，葉軍，等.新生兒期氨基酸、有機(jī)酸及脂肪酸氧化代謝疾病病譜分析[J].臨床兒科雜志，2012，30（9）：805-808.

[7] 張琳，李玲，孔海瑞，等.基于氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)的腎細(xì)胞癌患者尿液代謝組學(xué)分析[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015， 35（5）：763-766.

[8] 陳艷華，張瑞萍，宋詠梅，等.基于決速高分辨液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)尿液分析方法的建立[J].分析化學(xué)研究報(bào)告，2011，39（2）：173-177.

[9] 宋培培，馬玉花，韓萍，等.新疆維吾爾族和漢族大學(xué)生尿液代謝輪廓差異分析[J].分析化學(xué)，2015，43（10）：1565-1568.

[10] 曾凡勇，吳衛(wèi)紅，劉建軍，等.遺傳性代謝病高危患兒尿有機(jī)酸的篩查[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22（8）：947-951.

[11] 韓鳳，韓連書(shū)，葉軍，等.氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)的564例遺傳代謝病疾病譜分析[J].中華內(nèi)分泌雜志，2013，29（8）：693-695.

[12] 羅小平，王慕逖，魏紅，等.尿?yàn)V紙片法氣相色譜-質(zhì)譜分析技術(shù)在遺傳性代謝缺陷病高危篩查診斷中的應(yīng)用[J].中華兒科雜志，2003，41（4）：245-248.

[13] 孫衛(wèi)華，楊毅，曹迪，等.氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定尿有機(jī)酸方法的建立及在遺傳代謝病診斷中的應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，31（10）：1161-1165.

[14] Fu XW，Iga M，Kimura M. Simplified screening for organic acidemias using GC/MS and dried urine filter paper：a study on neonatal mass screening [J]. Early Human Development，2000，58（1）：41-55.

[15] 馬振菁，王滔，陳發(fā)同，等.氣相色譜法檢測(cè)健康人血清游離脂肪酸[J].福建醫(yī)學(xué)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，40（2）：179-181.

[16] 馬振菁，王滔，陳發(fā)同，等.血漿極長(zhǎng)鏈脂肪酸在腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良中的診斷價(jià)值及洛伐他汀對(duì)其影響[J].新醫(yī)學(xué)，2009，40（9）：587-588.

（收稿日期：2017-10-17 本文編輯：張瑜杰）