星點設(shè)計—效應(yīng)面法優(yōu)選皰毒清洗液提取工藝的研究

羅宇東 鐘江 譚安薔 方剛

[摘要] 目的 優(yōu)化皰毒清洗液提取工藝并進行質(zhì)量控制。 方法 采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法，以皰毒清水提液中沒食子酸及野黃芩苷含量為代表性指標，考查煎煮時間、加水量、提取次數(shù)三個因素對提取效果的影響，再經(jīng)中試生產(chǎn)驗證，篩選出皰毒清洗液最佳的水提工藝。 結(jié)果 皰毒清洗液最佳水提工藝為加10倍量水，煎煮提取2次，每次125 min。 結(jié)論 星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選的提取工藝重現(xiàn)性好，質(zhì)量穩(wěn)定，可作為皰毒清洗液的提取工藝。

[關(guān)鍵詞] 皰毒清洗液；星點設(shè)計-效應(yīng)面法；提取工藝；沒食子酸；野黃芩苷

[中圖分類號] R284.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（a）-0027-04

[Abstract] Objective To optimize the extraction process of Paoduqinq Lotion and to control its quality. Methods Through central composite design and response surface methodology， using gallic acid and scutellarin content as the indicators， the effects of the amount of water， extraction time， extraction frequency on water extraction process were investigated. The best water extraction process of Paoduqinq Lotion was obtained and varified by pilot scale test. Results The best water extraction process of Paoduqinq Lotion was performed by extracting the decoction with 10 times the amount of water twice， 125 min each time. Conclusion The optimized extraction process with good reproducibility and stable quality can be used as the extraction process of blister lotion.

[Key words] Paoduqinq Lotion； Central composite design and response surface methodology； Extraction process； Gallic acid； Scutellarin

皰毒清洗液是廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院擬研發(fā)的廣西民族藥醫(yī)療機構(gòu)制劑，該產(chǎn)品根據(jù)壯醫(yī)臨床驗方研制而成，以過塘蛇、半枝蓮為主藥，臨床治療帶狀皰疹有很好的效果，可有效縮短病程，減少患者痛苦，不留后遺癥，尤其在對預(yù)防帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛方面有獨特的作用[1]。本研究采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法，以沒食子酸及野黃芩苷含量為代表性指標并進行多指標綜合評價，優(yōu)化考察皰毒清洗液提取工藝并進行質(zhì)量控制，為其產(chǎn)品的規(guī)?；a(chǎn)提供理論支撐。

1 儀器與材料

島津LC-2030C 3D高效液相色譜儀，島津色譜工作站；島津C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；超聲清洗儀（上海冠特超聲儀器有限公司SG250HE型）；UV-2500分光光度計（日本島津）；METTLERAM100電子天平。

沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110831-201604）；野黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110739-2016）；甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑為分析純。

各藥材均購自南寧市友和古城大藥房，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學制藥廠質(zhì)量保證部鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 產(chǎn)品工藝設(shè)計

本產(chǎn)品處方是由民間驗方整理而來，經(jīng)醫(yī)院臨床使用療效顯著。本產(chǎn)品處方一直沿用藥材水煮濃縮后得到的洗劑劑型。由于洗劑制備簡單易行，溶媒來源廣，吸收迅速，顯效快，本研究在劑型選擇上沿用原來洗劑的劑型，在藥效不變的情況下達到方便患者的目的。因此，本產(chǎn)品工藝設(shè)計為藥材經(jīng)過水煮、濃縮、過濾后，加入適當?shù)姆€(wěn)定劑及防腐劑而制成洗劑，達到去粗取精的目的。

2.2 因素水平的確定

一般傳統(tǒng)的水提工藝考查因素主要包括煎煮加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)、藥材的粉碎度四要素。由于藥材粉碎度對中藥材水提的影響程度前人已經(jīng)做過許多研究，藥用部位為全草類的藥材切段后或者使用已制成飲片的藥材直接水提即能達到理想的浸提效果，所以在此次工藝考查中未將藥材粉碎度作為考查的因素。本實驗的工藝主要考查煎煮加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)3個因素。

由于提取次數(shù)為非連續(xù)變量，實際操作較為困難，故將提取次數(shù)確定為2次，選擇加水倍數(shù)及提取時間為自變量。根據(jù)星點設(shè)計的原理，采用2因素5水平試驗，水平用代碼值-α、-1、0、1、α來表示，因素水平見表1[2-8]。

2.3 試驗方法

2.3.1 提取液的制備

按處方比例精密稱取過塘蛇、半枝蓮等藥材，按表2進行提取，將提取液濃縮并定容至100 mL，即得藥材提取液。

2.3.2 沒食子酸的含量測定

2.3.2.1 供試品溶液的制備 精密吸取提取液10 mL，置于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度溶解，混勻，取10 mL進行離心，再取上清液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，作為供試品溶液。

2.3.2.2 對照品溶液的制備 稱取沒食子酸對照品適量，加甲醇制成1 mg/mL對照品溶液。

2.3.2.3 含量測定 將對照品溶液和供試品溶液分別注入LC-2030C 3D高效液相色譜儀，采用如下色譜條件檢測：色譜柱，島津C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相，甲醇-0.1%磷酸溶液（8∶92，V/V）；檢測波長，270 nm；流速，1.0 mL/min；進樣量，10 μL；柱溫：室溫。理論塔板數(shù)按沒食子酸計算應(yīng)不少于5000。

2.3.3 野黃芩苷的含量測定

2.3.3.1 供試品溶液的制備 精密吸取提取液1.00 mL，蒸干，精密加入甲醇50 mL，稱重，超聲1 h，補足甲醇損失重量，過濾，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液25 mL至50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾后待測。

2.3.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取野黃芩苷4 mg，加甲醇制成50 mL（每1 mL含野黃芩苷80 μg）。

2.3.3.3 含量測定 將對照品溶液和供試品溶液分別注入LC-2030C 3D高效液相色譜儀，采用如下色譜條件檢測：色譜柱為C-18甲基硅烷柱；流動相為甲醇∶冰醋酸溶液（1→41）（40∶60）；檢測波長335 nm；流速1 mL/min；進樣量10 μL，柱溫為室溫。理論塔板數(shù)按野黃芩苷計算應(yīng)不少于1500。

2.4 數(shù)據(jù)處理

將表2中的沒食子酸、野黃芩苷的數(shù)值標準化為0～1間的歸一值（d，desirability），d=（Yi-Ymin）/（Ymax- Ymin），并將歸一值求加權(quán)算術(shù)幾何平均數(shù)，得加權(quán)總評歸一值（OD，overall desirability）。OD = d10.5d20.5，結(jié)果見表2。

2.5 響應(yīng)面分析結(jié)果

將表2中數(shù)據(jù)運用Design-Expert 8.0.5b軟件進行響應(yīng)面分析，以O(shè)D值（Y）為響應(yīng)值分別對各因素進行多元線性和二項式擬合，模型的好壞通過復相關(guān)系數(shù)進行判定。多元線性模型擬合方程如下：Y = -0.757 92+0.060 518A+0.009 087 46B（R2 = 0.8409）；二次多項式模型擬合方程如下：Y = -3.317 33+0.504 77A+0.024 658B-0.000 214 286AB-0.023 609A2-0.000 075 786 6 B2（R2 = 0.9507）。兩者比較可知，二次多項式模型擬合方程的相關(guān)系數(shù)明顯高于多元線性模型擬合方程的相關(guān)系數(shù)，說明該提取工藝各項指標采用二次多項式方程擬合更為恰當，故選擇二次多項式擬合方程優(yōu)選工藝參數(shù)。并對模型采用F檢驗進行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，各因素對提取液中沒食子酸、野黃芩苷含量影響的主次順序為B>A，二次多項式模型達極顯著水平，說明該方程與實際情況擬合度良好，且相對于多元線性擬合的R2有所提高，可信度及預(yù)測性更好，可利用該模型分析預(yù)測最佳工藝條件。

2.6 工藝參數(shù)優(yōu)化和預(yù)測

根據(jù)上述擬合二次多項式模型，繪制因變量隨自變量變化的二維等高圖和三維效應(yīng)面圖，見圖1。通過等高線圖，可知提取較佳的工藝范圍：A，8.69～11.37倍；B，124.79～132 min。綜合考慮生產(chǎn)成本及操作可控性，該試驗選取的最佳提取工藝應(yīng)：加10倍量水煎煮提取2次，每次125 min。

2.7 驗證實驗

取處方中各藥材，按照最佳工藝條件進行提取，即加10倍量水煎煮提取2次，每次125 min。測定其提取液中沒食子酸、野黃芩苷的含量，計算OD值，結(jié)果為0.9897；按照擬合方程計算得到的預(yù)測值結(jié)果（0.9997）偏差1.14%，表明優(yōu)選的提取工藝預(yù)測性良好，所選工藝條件重現(xiàn)性好，結(jié)果見表4。

3 討論

皰毒清洗液中過塘蛇為方中主藥，過塘蛇為豆科植物，根莖具有祛風除濕、活血通絡(luò)的功效，主治風濕痹痛、跌打損傷、腰肌勞損、四肢麻木?，F(xiàn)代藥理學研究表明，過塘蛇具有抗氧化、解毒消腫、保肝護肝、對腫瘤細胞的抑制和抗炎作用；過塘蛇的主要活性成分類型有酚性成分、黃酮類、氨基酸、糖類等成分，其中沒食子酸為其代表性成分之一[9-14]。處方中另一味主藥為半枝蓮，半枝蓮性辛，微苦，性涼，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有清熱解毒、化瘀止血、利水消腫等功效?，F(xiàn)代研究表明，半枝蓮的主要活性成分為黃酮類和二萜類化合物，亦含有生物堿、甾體、多糖等成分，其中野黃芩苷為黃酮類化合物的代表性成分[15-20]。中成藥作為一個整體，強調(diào)的是各味藥的協(xié)同作用。中成藥中單一有效成分或指標成分控制，難以真正控制藥品質(zhì)量，而采用多指標多成分的含量測定方法將成為中成藥未來質(zhì)量控制方法的主流。因此，本試驗以沒食子酸及野黃芩苷含量為代表性指標考察制劑的提取工藝比較全面、合理。

課題組前期對皰毒清洗液過塘蛇所含的沒食子酸含量測定進行了方法學考察，采用HPLC法，沒食子酸進樣量在0.162～0.810 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r = 0.9997），平均回收率為100.06 %，RSD = 1.87 %（n = 6），測定10批皰毒清洗液樣品中沒食子酸的平均含量為15.65 mg/g（RSD = 0.55 %）。色譜條件選擇時，用甲醇-0.1%磷酸作為流動相，各成分分離效果較好，經(jīng)全波長掃描，發(fā)現(xiàn)最大吸收波長為270 nm；另外，皰毒清洗液半枝蓮中野黃芩苷含量的測定也進行了方法學考察，采用高效液相色譜法，結(jié)果野黃芩苷進樣量在0.125～0.80 μg范圍內(nèi)，進樣量與吸收峰面積呈線性關(guān)系。平均回收率為97.6%（RSD = 1.0%，n = 5）。測定10批皰毒清洗液樣品中的野黃芩苷平均含量為4.13 mg/mL（RSD = 1.20%）。流動相為甲醇∶冰醋酸溶液（1→41）（40∶60），檢測波長335 nm，各成分分離效果較好?？梢?，以上測定皰毒清洗液水提液中沒食子酸及野黃芩苷含量的方法可用于其提取工藝的優(yōu)化研究。

正交設(shè)計、均勻設(shè)計、星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法為近年來在藥學領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的三種設(shè)計和優(yōu)化法，可用于中藥提取、炮制、制粒、處方篩選等諸多方面。三種設(shè)計方法各有優(yōu)缺點及使用范圍。星點設(shè)計-效應(yīng)面法在中藥提取優(yōu)化研究方面具有顯著的優(yōu)勢，主要為試驗次數(shù)較少，試驗精度高，并適用于多因素、多水平的試驗，相比正交設(shè)計法更簡化，比均勻設(shè)計法更全面[3-8]。因此，本文采用星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化皰毒清洗液提取工藝，優(yōu)化后的工藝穩(wěn)定可控，重現(xiàn)性好，適用于實際生產(chǎn)。

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