冠狀動脈CT成像不同管電壓對外周血淋巴細胞DNA雙鏈斷裂影響的研究

林竹瀟， 張龍江， 周長圣， 周帆， 顧海峰， 鮑雪芹， 盧光明

冠狀動脈CT成像(coronary CT angiography，CCTA)已成為疑似冠心病患者的首選影像檢查方法[1-3]，但是伴隨而來的是人群輻射暴露的增加。目前有多種技術(shù)，如降低管電壓和管電流、適當(dāng)?shù)那爸脼V過器、ECG調(diào)制電流技術(shù)、增加螺距及層面厚度等可用于降低CCTA的輻射劑量[4-7]，其中降低管電壓是降低輻射劑量最有效的方法。

輻射劑量的評估常用有效劑量(effective dose，ED)、CT容積劑量指數(shù)(volume CT dose index，CTDIvol)、劑量長度乘積(dose-length product，DLP)及水當(dāng)量體型特異性劑量估算值(water equivalent size specific dose estimate，water equivalent SSDE)等指標，其對人體輻射的評價存在±40%的不確定性，而生物學(xué)指標更能直接地反映輻射風(fēng)險[8]。在生物學(xué)評價指標中，DNA雙鏈斷裂(double strand breaks，DSBs)是反映輻射的生物學(xué)損傷最有價值的表現(xiàn)[9]。DNA損傷信號反應(yīng)通路存在多種蛋白，其中磷酸化的H2AX(γ-H2AX)蛋白和共濟失調(diào)毛細血管擴張突變(ataxia telangiectasia-mutated，ATM)蛋白可以作為DNA雙鏈斷裂的標記物[10]。目前大部分研究采用免疫熒光顯微鏡作為檢測γ-H2AX焦點的方法，但流式細胞儀分析DNA雙鏈斷裂的結(jié)果更客觀、實驗周期更短[11]。本研究旨在利用流式細胞儀評價不同管電壓的CCTA對DNA雙鏈斷裂的影響。

材料與方法

1.研究對象

本研究采用前瞻性設(shè)計，選取2016年4月-2017年7月間行CCTA檢查的患者120例，隨機分為A、B、C、D四組，分別行管電壓為120 kV、100 kV、80 kV及70 kV的CCTA掃描。研究對象納入標準：年齡大于18周歲、體質(zhì)量指數(shù)<25 kg/m2、未患淋巴瘤或白血病、6個月內(nèi)未行放射治療或化療、1周內(nèi)未接受X線或核醫(yī)學(xué)檢查。因樣本保存條件欠佳，排除3例患者后，最終117例患者納入本組研究。本研究已通過倫理委員會審查許可，研究對象均簽署知情同意書。

2.檢查方法

所有納入患者的CT掃描均采用第二代雙源CT掃描儀(Somatom Definition Flash，Siemens Healthineers，F(xiàn)orchheim，Germany)。CT掃描經(jīng)定位像確定掃描范圍后，利用Lrich雙筒高壓注射器向患者外周靜脈內(nèi)注射非離子對比劑優(yōu)維顯60 mL(370 mg I/mL)，注射流率5 mL/s；延遲時間應(yīng)用人工智能觸發(fā)掃描系統(tǒng)確定，將興趣區(qū)投至升主動脈，當(dāng)CT值達到100 HU即可觸發(fā)掃描。A、B、C、D四組管電壓分別為120 kV、100 kV、80 kV、70 kV；其余參數(shù)保持一致：管電流280 mA，機架旋轉(zhuǎn)時間0.28 s；四組掃描范圍相同。

3.血樣處理

每位患者于檢查前及檢查后20 min分別抽取血液2 mL裝入肝素抗凝管，并用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)1:1稀釋。將稀釋的血液置于外周血淋巴細胞分離液(MP Biomedicals，Solon，OH)之上，在離心機內(nèi)以2100 rpm離心30 min后，用吸管洗出淋巴細胞層，并用PBS清洗2遍。將細胞密度調(diào)整為1×106個/ml，4%多聚甲醛4℃固定過夜。用PBS洗去固定液(1200 rpm離心，5 min)后，以0.1% Triton X-100冰上處理細胞5 min，并再用PBS洗滌細胞2次(1200 rpm離心，5 min)。最后使用FITC-CD3抗體(BD Biosciences，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)、APC-γ-H2AX抗體(BD Biosciences，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)及PE-ATM抗體(Millipore，Billerica，MD)孵育重懸細胞，室溫下避光保存30 min。

4.流式檢測

用流式細胞儀(FACScanto，BD Bioscience)對樣品進行檢測。首先圈出CD3+T淋巴細胞群體，再根據(jù)陰性管設(shè)置閾值，并對APC及PE兩種熒光進行補償調(diào)整；每管樣品均計數(shù)104個CD3+T淋巴細胞，最后分別計算標記了γ-H2AX及ATM兩種蛋白的細胞占CD3+ T淋巴細胞的百分比。

5.統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

1.人口學(xué)特征

A、B、C、D四組間的年齡、性別、身高、體重及體質(zhì)量指數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.195、0.836、0.998、0.947及0.204，表1)。

2.組內(nèi)比較結(jié)果

在不同管電壓下，檢查后與檢查前相比，A、B、C、D四組γ-H2AX和ATM陽性細胞百分比均升高，四組檢查后與檢查前結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。經(jīng)CCTA檢查后，四組γ-H2AX陽性細胞百分比改變值的中位數(shù)分別為2.2%、1.6%、0.8%、1.9%，ATM陽性細胞百分比改變值的中位數(shù)分別為2.6%、2.2%、2.3%、4.7%(表2，圖1)。

表1 A、B、C、D四組間的人口學(xué)特征

表2 A、B、C、D四組間γ-H2AX及ATM陽性細胞百分比及檢查前、后差值

圖1 不同管電壓條件下，CCTA檢查后與檢查前相比，γ-H2AX 與ATM陽性細胞百分比均升高，表示P<0.05。a) CCTA檢查前、后γ-H2AX陽性細胞百分比； b) CCTA檢查前、后ATM陽性細胞百分比。

3.組間比較結(jié)果

隨著管電壓由120 kV降低至80 kV，γ-H2AX陽性細胞百分比的差值逐漸下降，進一步降低至70 kV，γ-H2AX陽性細胞百分比的差值上升；兩兩比較結(jié)果顯示，除A組與C組(P=0.007)、B組與C組之間(P=0.003)差異有統(tǒng)計學(xué)意義外，其余組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)，D組的陽性細胞百分比的差值與其他三組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。管電壓為70 kV時，ATM陽性細胞百分比的差值最大，管電壓為100 kV時，ATM陽性細胞百分比的差值最小，四組間陽性細胞百分比的差值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.381，表2，圖2)。

討 論

本研究結(jié)果證實CCTA管電壓降低至80 kV能夠有效減少DNA雙鏈斷裂。另外，管電壓由120 kV降低至100 kV后未見DNA雙鏈斷裂顯著減少；同時，70 kV管電壓的應(yīng)用并沒有明顯降低DNA雙鏈斷裂。

圖2 四組間CCTA檢查后與檢查前γ-H2AX及ATM陽性細胞百分比的差值比較，表示P<0.05。γ-H2AX陽性細胞百分比的差值，除A組與C組(P=0.007)、B組與C組間(P=0.003)差異有統(tǒng)計學(xué)意義外，其余組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。四組間ATM陽性細胞百分比的差值的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。

CCTA檢查后γ-H2AX水平會升高[12]，有研究表明，即使是非常低的輻射劑量(約1 mGy)，也可以誘導(dǎo)細胞中DSBs的發(fā)生[13]。因此在實際檢查過程中，通常會采用多種技術(shù)降低CCTA的輻射劑量；其中，降低管電壓是降低輻射劑量的主要方法[14-16]，目前已經(jīng)實現(xiàn)最低至70 kV的CCTA掃描[17-18]。有研究認為，盡管管電壓的降低會造成圖像噪聲的增加，但在同時采取其他措施(如自動曝光控制、重建方法等[19-21])的條件下，最終沒有引起圖像質(zhì)量的明顯降低。然而，管電壓的降低使射線穿透力下降，被人體吸收的散射線增加。有研究證實，相比于高管電壓(140 kV)，低管電壓(80 kV)引起了DNA雙鏈斷裂增加[22]。本研究結(jié)果顯示，管電壓為80 kV時，發(fā)生DNA雙鏈斷裂的細胞最少，隨著管電壓進一步降低至70 kV，發(fā)生DNA損傷的細胞增多。兩項研究結(jié)果存在差異的原因可能是掃描條件和檢測手段的不同；前者在降低管電壓的同時提高管電流，與后者保持管電流一致相比，可能會造成輻射損傷的增加。雖然多數(shù)研究采用免疫熒光顯微鏡進行DNA雙鏈斷裂的檢測，而且敏感性可能高于流式細胞術(shù)；但已有文獻證實，流式細胞術(shù)的敏感性可滿足臨床上DNA損傷的檢測要求[23]；Nguyen等[10]也認為，應(yīng)用流式細胞儀檢測T淋巴細胞中發(fā)生DNA雙鏈斷裂的細胞比例變化同樣能夠反映DNA損傷與輻射劑量的關(guān)系，并且檢查前后ATM陽性細胞百分比改變程度高于γ-H2AX的結(jié)果也與文獻報道一致。本研究結(jié)果進一步證實，γ-H2AX較ATM更能檢測不同管電壓之間的區(qū)別，是一種檢測DNA雙鏈斷裂更敏感的指標。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示經(jīng)流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)將管電壓降低至80 kV時，DNA雙鏈斷裂降至最低；而進一步降低管電壓至70 kV，DNA雙鏈斷裂出現(xiàn)上升趨勢。因此，通過降低管電壓的方法降低CCTA的輻射劑量，應(yīng)將管電壓降低至80 kV為宜。

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