安卡紅曲霉酸性蛋白酶分離純化及部分酶學性質(zhì)分析

袁江蘭，何首春，康 旭，黃亞明，陳曉敏

（湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068）

紅曲霉是亞洲地區(qū)最重要的工業(yè)發(fā)酵微生物之一，在食品發(fā)酵、紅曲色素生產(chǎn)、次級代謝產(chǎn)物獲取等方面應(yīng)用廣泛[1-2]。紅曲霉在發(fā)酵過程中可形成豐富的酶系，包括蛋白酶、淀粉酶等，但產(chǎn)酶類型及產(chǎn)量因菌株種類不同而表現(xiàn)出較大的差異[3]，有些紅曲霉菌株可產(chǎn)生活性較高的蛋白酶，在蛋白類發(fā)酵的食品中可顯著增強食品口感和營養(yǎng)價值，如利用于發(fā)酵魚、肉、豆腐、醬油等高蛋白食品[4]。紅曲霉一直是食品微生物領(lǐng)域的研究熱點，但主要集中于紅曲色素，雖然紅曲霉蛋白酶對于高蛋白食品具有重要意義，但對紅曲霉蛋白酶的研究報道卻很少，已有的報道包括高粱紅曲霉酸性蛋白酶[5-6]、紫色紅曲霉CCRC 31499的一種胞外蛋白酶[7]、叢毛紅曲霉的酸性蛋白酶等[8]。有些紅曲霉常用于紅腐乳發(fā)酵，如安卡紅曲霉（Monascus anka）、紅色紅曲霉，在腐乳發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的游離氨基酸，這與紅曲霉蛋白酶對大豆蛋白的水解密切相關(guān)[9]。雖然關(guān)于紅曲霉酸性蛋白酶的研究報道較少，但可見關(guān)于其他屬曲霉菌酸性蛋白酶的研究報道，如臭曲霉[10]、米曲霉[11]、黑曲霉[12]等。M. anka CICC 40806產(chǎn)紅色素，來源于發(fā)酵腐乳，能制作風味良好的紅腐乳，這與微生物對蛋白的降解具有密切相關(guān)性，但關(guān)于M. anka蛋白酶鮮見研究報道。本研究在利用M. anka CICC 40806發(fā)酵米渣蛋白醬油的研究過程中，發(fā)現(xiàn)它能產(chǎn)生較高活力的胞外酸性蛋白酶，因此對其進行分離純化，并對其部分酶學性質(zhì)進行初步研究，將其用于米渣蛋白的發(fā)酵降解，以評價其對這種難溶解、難降解的大米濃縮蛋白的降解效率，為紅曲霉在米渣蛋白中的應(yīng)用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

M. anka CICC 40806 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；米渣 湖北德安府糖業(yè)有限責任公司。

干酪素（分析純）、福林-酚試劑（生化純） 國藥集團化學試劑有限公司；牛血清蛋白（生化純）Biosharp生物科技公司；CM sepharose Fast Flow 美國GE Healthcare公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LHS-150SC恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海齊欣科學儀器有限公司；FD-1真空冷凍干燥機 杭州匯爾有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）儀美國伯樂公司；Sorvall Lynx6000高速離心機 美國Thermo Fisher公司；DBS-100全自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 M. anka CICC 40806的培養(yǎng)

實驗中共用到3 種紅曲霉培養(yǎng)基，分別為用于紅曲霉菌種保藏和活化的固體斜面PDA培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基[5]和制曲固體培養(yǎng)基[6]。其中制曲固體培養(yǎng)基按照米渣-面粉-麩皮-水質(zhì)量比6∶2∶2∶7.8進行配料、蒸料，pH值自然。具體操作：斜面保藏的紅曲霉菌種M. anka CICC 40806先用新鮮的固體斜面培養(yǎng)基進行活化培養(yǎng)，然后挑取少量活化菌種接種于液體種子培養(yǎng)基中，32 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)5 d，再接入制曲固體培養(yǎng)基中，32 ℃培養(yǎng)3 d得成曲，期間每隔24 h翻曲1 次。

1.3.2 M. anka酸性蛋白酶的分離純化

稱取80 g成曲，加入20 倍質(zhì)量的蒸餾水，40 ℃水浴攪拌提取1 h，過濾得粗酶液。然后按照20%、30%、40%、50%、60%、80%、90%硫酸銨飽和度進行分級沉淀，分別測定各飽和度硫酸銨上清液和沉淀的酸性蛋白酶活力，分別以酶活力最高處為100%作圖，確定硫酸銨沉淀蛋白酶飽和度范圍。硫酸銨分級沉淀所得蛋白酶4 ℃透析脫鹽（透析袋截留分子質(zhì)量為7 kDa），濃縮后凍干。凍干粉溶解于0.05 mol/L的pH 3.0的乳酸-乳酸鈉緩沖溶液，上CM-Sepharose FF層析柱，以含0、0.10 mol/L NaCl的乳酸-乳酸鈉緩沖溶液（pH 3.0）進行階梯式梯度洗脫，280 nm波長處檢測，收集穿過峰和各洗脫峰，測酸性蛋白酶活性。

1.3.3 蛋白酶活力的測定

采用福林-酚法[7]。蛋白酶活力定義：40 ℃每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1 個活力單位（U）。比活力是指每毫克酶蛋白所包含的酶活力單位，在純化過程中用比活力表示酶活可以更清晰地表示出各步驟純化的效果和酶的純度。

1.3.4 SDS-PAGE分析

參考Laemmli等[8]的方法。

1.3.5 酶學性質(zhì)分析

1.3.5.1 最適pH值和pH值穩(wěn)定性

乳酸-乳酸鈉緩沖溶液（pH 2.0、3.0、4.0、5.0），磷酸緩沖溶液（pH 6.0、7.0、8.0），硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液（pH 9.0、10.0），于40 ℃進行酶促反應(yīng)，分別測定酸性蛋白酶活力，其中以最高酶活力為100%，計算其他pH值條件下的相對酶活力，確定酶的最適pH值。

將純化的酸性蛋白酶用上述緩沖體系分別調(diào)節(jié)pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，并在40 ℃保溫60 min，再于最適pH值測定酸性蛋白酶活力。以最高酶活力為100%，計算其他pH值條件下的相對酶活力，確定酶的pH值穩(wěn)定性。

1.3.5.2 最適溫度、溫度穩(wěn)定性和熱失活動力學

在最適pH值下，分別于20、30、40、50、60、70 ℃進行酶催化反應(yīng)，測定酸性蛋白酶活力，以最高酶活力為100%，計算其他溫度添加下的相對酶活力，確定酶的最適反應(yīng)溫度。

在最適pH值下，將酸性蛋白酶分別置于40、50、60 ℃水浴保溫0、20、40、60、80、100 min，再于40 ℃測定酸性蛋白酶活力，以保溫0 min的酶活力為100%，計算其他條件下的相對酶活力，確定酶的溫度穩(wěn)定性。

溫度失活動力學參考Li Caihong等[9]方法。將純化后的蛋白酶液適當稀釋，于50 ℃水浴保溫，每間隔1 h取樣并測定酸性蛋白酶活力，以保溫0 h的蛋白酶活力為100%。以相對酶活力-時間作圖，然后按式（1）進行指數(shù)衰減動力學模型擬合，以此分析蛋白酶的熱穩(wěn)定性。

式中：N0為擬合值；t為時間/h；λ為衰減指數(shù)，反映酶活力隨時間衰減的速率。

1.3.5.3 耐鹽性和鹽穩(wěn)定性

配制NaCl質(zhì)量分數(shù)分別為0%、1.0%、4.0%、7.0%、10.0%、15.0%的酶液，于pH 3.0、40 ℃條件下進行催化反應(yīng)，測定酸性蛋白酶活力，以NaCl質(zhì)量分數(shù)為0%時的酶活力為100%，計算其余NaCl質(zhì)量分數(shù)下的相對酶活力。

配制NaCl質(zhì)量分數(shù)為15.0%的酶液，4 ℃條件下放置10 d，每2 d測定一次酶活力，并以初始酶活力為100%，計算相對酶活力，考察酶的鹽穩(wěn)定性。

1.3.6 活化能測定

根據(jù)Arrhenius方程的反應(yīng)動力原理測定活化能[10]。蛋白酶在低于最適反應(yīng)溫度時具有較好的熱穩(wěn)定性，在該溫度范圍內(nèi)蛋白酶的失活速率很低，可以忽略，其酶促反應(yīng)的速率符合Arrhenius方程。由于底物過量，因此酶促反應(yīng)遵循零級化學反應(yīng)的規(guī)律。根據(jù)這一理論，以酪蛋白為底物，分別于10、20、30、40、50、60、70 ℃進行酶催化反應(yīng)，計算反應(yīng)速率，確定溫度與酶促反應(yīng)速率的相關(guān)性。

1.3.7 底物種類的選擇性

參考林建城等[11]方法。以pH 3.0的乳酸-乳酸鈉緩沖溶液配制底物質(zhì)量濃度分別為1.0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0、18.0 g/L的酪蛋白、米渣蛋白和牛血清蛋白溶液，測定M. anka酸性蛋白酶對不同種類和質(zhì)量濃度底物的催化反應(yīng)速率。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法比較M. anka蛋白酶催化不同底物反應(yīng)的米氏方程中米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨飽和度的選擇

硫酸銨沉淀法可從大量粗酶中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)，且不易使蛋白質(zhì)變性[20]。如圖1所示，在硫酸銨飽和度達到20%時有沉淀析出，并且上清液檢測到酸性蛋白酶活力。沉淀部分的蛋白酶活力隨硫酸銨飽和度的增加而增加，上清液酶活力隨著硫酸銨飽和度的增加不斷減小。當硫酸銨飽和度達到80%時，沉淀中酶活力接近最大值而上清液中幾乎檢測不到酶活力，故80%的硫酸銨飽和度可以沉淀目標蛋白[21]。因此，采用20%～80%飽和度硫酸銨分級沉淀M. anka酸性蛋白酶，硫酸銨分級區(qū)間過大會造成雜蛋白去除有限。

圖1 不同硫酸銨飽和度對上清液及沉淀蛋白酶活力的影響Fig. 1 Effect of saturation degree of ammonium sulfate on the protease activity of supernatant fluid and precipitate

2.2 M. anka酸性蛋白酶的純化

收集20%～80%飽和度硫酸銨鹽析所得沉淀，透析后制成凍干粉。層析時首先將凍干粉溶解于0.05 mol/L的乳酸-乳酸鈉緩沖溶液（pH 3.0）中，離心并經(jīng)微孔濾膜過濾，然后上樣于平衡好的CM-Sepharose Fast Flow層析柱，使流速控制在2 mL/min，每2 mL收集1 管，待洗脫兩個柱體積后，利用含0.1 mol/L NaCl的緩沖液進行階梯式梯度洗脫，收集并測定各管酸性蛋白酶活力，洗脫曲線如圖2所示。檢測到第43管酶活力最高，合并酶活力最高部分并透析、濃縮。

圖2 M. anka酸性蛋白酶的CM Sepharose Fast Flow洗脫曲線Fig. 2 Purification of proteases from M. anka with CM Sepharose Fast Flow

圖3 M. anka酸性蛋白酶的SDS-PAGEFig. 3 SDS-PAGE of the protease from M. anka

純化過程的樣品進行SDS-PAGE，結(jié)果見圖3，經(jīng)硫酸銨鹽析后的樣品中含有2 個主要條帶，陰離子交換層析收集的高酶活力部分含1 個主要條帶，表明酶的純度較高，酶分子質(zhì)量介于44.3～66.4 kDa之間，明顯高于高粱紅曲霉酸性蛋白酶（34 kDa）[6]。M. anka酸性蛋白酶的純化結(jié)果見表1。實驗采用0.10 mol/L NaCl溶液進行階梯式梯度洗脫，因此酸性蛋白酶流出時的NaCl濃度約為0.10 mol/L。在實驗設(shè)計時，考慮到要在一塊板上同時跑原樣、硫酸銨分級沉淀樣品和離子交換層析樣品，以使結(jié)果更有可比性，但是由于各部分實驗間隔時間較長，因此分別進行各樣品電泳，通過Marker比對大致比較兩個樣品。這是實驗中存在的一個缺陷，在以后的研究中要避免。

表1 M. anka酸性蛋白酶的純化Table 1 Purification of acid protease from M. anka

2.3 pH值對M. anka酸性蛋白酶的影響

圖4 M. anka純化蛋白酶最適pH值（a）和pH值穩(wěn)定性（b）Fig. 4 Optimum pH (a) and pH stability (b) of purified protease from M. anka

圖4a表明，M. anka酸性蛋白酶的最適反應(yīng)pH值為3.0，與高粱紅曲霉、宇佐美曲霉等酸性蛋白酶相同[6,22]，而臭曲霉的最適反應(yīng)pH值為5.0[10]，說明不同來源的酸性蛋白酶結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可能存在較大差別。pH值低于2.5或高于4.0時，酶催化活力迅速下降。由圖4b可見，穩(wěn)定的pH值范圍為3.0～7.0，與高粱紅曲霉酸性蛋白酶相似（3.0～6.0）[6]。在2.0～3.0的范圍內(nèi)，pH值對M. anka酸性蛋白酶的活力影響非常顯著，pH值小幅下降會引起酶活力迅速下降，當pH值為2.0時，酶基本失活。而當pH值大于7.0，隨著pH值增加酶活力也迅速降低。這均與酶結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，與叢毛紅曲霉胞外酸性蛋白酶規(guī)律相似[8]。pH值改變導致酶蛋白空間構(gòu)象改變，甚至引起酶變性失活。在最適pH值時，酶的解離狀態(tài)往往是最有利于該酶與底物結(jié)合并發(fā)生催化反應(yīng)，使酶活力達到最大。另外，pH值還會影響到代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性[23]。

2.4 溫度對M. anka酸性蛋白酶的影響

圖5 M. anka酸性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度（a）和溫度穩(wěn)定性（b）Fig. 5 Optimum temperature (a) and temperature stability (b) of acid protease from M. anka

由圖5可知，M. anka酸性蛋白酶的最適溫度約為50 ℃，低于50 ℃時較穩(wěn)定，溫度高于50 ℃時，酶活力迅速下降，這與紫色紅曲霉白色突變株（M. purpureus mutant W1）酸性蛋白酶相似[23]。較高溫度對酶促反應(yīng)具有促進作用，但溫度超過一定范圍時酶活力開始下降，反映了酶作為生物催化劑的本質(zhì)[28]。

圖6 M. anka酸性蛋白酶熱失活曲線Fig. 6 Heat inactivation curve of acid protease from M. anka

M. anka酸性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度約50 ℃，在50 ℃進行酶的熱失活動力學研究，結(jié)果見圖6。根據(jù)一級指數(shù)衰減動力學模型方程求酶衰減指數(shù)為0.569。黑曲霉CICC2377、米曲霉HN3042衰減常數(shù)分別為0.76、0.50[24]。臭曲霉酸性蛋白酶也符合一級動力學模型，但其熱穩(wěn)定性高，溫度從55 ℃升高至70 ℃時，失活速率常數(shù)由0.018 h－1增加至5.06 h－1，半衰期由37.6 h縮短至0.13 h[10]。衰減指數(shù)越大表明酶對溫度的耐受性越差，溫度穩(wěn)定性也越差。由此可見，溫度對不同來源的真菌酸性蛋白酶的影響有很大差別。

2.5 NaCl對M. anka酸性蛋白酶的影響

圖7 NaCl對蛋白酶活力（a）和穩(wěn)定性（b）的影響Fig. 7 Effect of NaCl concentration on the activity (a) and stability (b)of purified protease

紅曲霉常用于發(fā)酵食品中，因此鹽對微生物及其酶系的影響非常重要。由圖7a可知，NaCl對M. anka酸性蛋白酶具有一定的抑制作用，隨著NaCl質(zhì)量分數(shù)的升高，相對酶活力逐漸減小。當質(zhì)量分數(shù)為1%時，相對酶活力為62%，當NaCl質(zhì)量分數(shù)達到7%時，相對酶活力僅為12%。而在8%的NaCl質(zhì)量分數(shù)下，米曲霉CICIM F0899剩余蛋白酶活力為50%[25]。這種耐鹽性的明顯差異與酶的結(jié)構(gòu)有直接關(guān)系。米曲霉耐鹽性很好，因此在高鹽環(huán)境中仍然能保持較高酶活力。由圖7b可知，在15% NaCl質(zhì)量分數(shù)條件下進行發(fā)酵，2 d后M. anka酸性蛋白酶活力緩慢下降。圖7數(shù)值上的差異與初始酶液的活力值有關(guān)。實驗采用相對酶活力來評價耐鹽性，圖7a是酶液在NaCl溶液中保持1 h后所測結(jié)果，由于無鹽酶液活性較高，所以含鹽酶液活力下降導致相對酶活力下降明顯；而圖7b是酶液在15% NaCl溶液中保持1 h后再測定計算所得數(shù)據(jù)，初始酶活力已經(jīng)明顯下降，因此其他所有樣品計算所得相對酶活力較高，事實上，15% NaCl溶液中保存的酶液活力已經(jīng)很低，說明在高鹽環(huán)境下M. anka酸性蛋白酶活力基本喪失。

2.6 M. anka酸性蛋白酶催化反應(yīng)的活化能

反應(yīng)溫度每提高10 ℃所增加的反應(yīng)速率為反應(yīng)溫度系數(shù)，各溫度反應(yīng)速率和反應(yīng)溫度系數(shù)見表2。在低于50 ℃時反應(yīng)速率隨反應(yīng)溫度的升高而增加，但40～50 ℃之間增加緩慢，高于50 ℃則反應(yīng)速率迅速降低。在酶促反應(yīng)中，溫度升高，反應(yīng)速率加快，但同時酶的失活速率也加快，所以酶促反應(yīng)的速率是由反應(yīng)速率和失活速率兩方面作用疊加的結(jié)果。因此，在高于50 ℃條件下，隨著溫度的升高，蛋白酶的失活速率高于反應(yīng)速率，而低于50 ℃時，失活速率小于反應(yīng)速率，甚至可以忽略不計，符合Arrhenius方程。

表2 不同溫度段的反應(yīng)溫度系數(shù)Table 2 Q at different temperature zones

由于設(shè)定的底物質(zhì)量濃度在反應(yīng)10 min內(nèi)對反應(yīng)速率無影響，因此該酶促反應(yīng)為零級反應(yīng)[28]，符合零級反應(yīng)公式：

式中：r為反應(yīng)速率/（μg/（mL·min））；Cs為底物質(zhì)量濃度/（μg/mL）；t為反應(yīng)時間/min；n為常數(shù)；k為反應(yīng)速率常數(shù)。

Arrhenius方程：

式中：A為指前因子；Ea為反應(yīng)活化能/（kJ/mol）；R為氣體常數(shù)（8.31 J/（mol·K））；T為絕對溫度/K。

圖8 酶促反應(yīng)速率的Arrhenius圖Fig. 8 Relationship between reaction rate and temperature according to Arrhenius equation

根據(jù)Arrhenius方程，以lnk-1/T作圖，因為r=nk，以lnr-1/T作圖即可得斜率條件下反應(yīng)溫度與反應(yīng)速率的關(guān)系如圖8表示。可得M. anka酸性蛋白酶在10～50 ℃條件下水解酪蛋白的反應(yīng)活化能Ea為28.85 kJ/mol。米曲霉HN3042和黑曲霉CICC 2377酸性蛋白酶Ea分別為64.61 kJ/mol和63.11 kJ/mol[17]。酶對活化能的影響源自于酶與底物的結(jié)合能力，酶與底物結(jié)合形成的復合物所含能量較低，從而使反應(yīng)易于發(fā)生，因此酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象對反應(yīng)的活化能有直接影響。酶可以通過降低活化能來促進一些原本很慢的生化反應(yīng)得以快速進行[29]。已知化學反應(yīng)速率與其活化能的大小密切相關(guān)，活化能越低，反應(yīng)速率越快，可見M. anka酸性蛋白酶催化反應(yīng)速率相對較高，因此M. anka用于發(fā)酵高蛋白食品對蛋白質(zhì)快速降解有利[30]。

2.7 M. anka酸性蛋白酶的底物選擇性及米氏常數(shù)

為消除蛋白酶失活對反應(yīng)速率的影響，將反應(yīng)溫度設(shè)定為40 ℃，反應(yīng)時間為10 min，以不同質(zhì)量濃度的酪蛋白、米渣蛋白、牛血清蛋白為底物，用每毫升稀釋酶液經(jīng)陰離子交換層析洗脫后，收集到酸性蛋白酶活力高的部分，合并后透析、濃縮，低溫存放。測定時統(tǒng)一取酶樣稀釋，用毫升計量，以比較對底物的選擇性。每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生的產(chǎn)物的微克數(shù)表示反應(yīng)速率，測定底物種類和濃度對反應(yīng)速率的影響。

假定該蛋白酶以酪蛋白為底物水解生成酪氨酸的反應(yīng)符合米氏方程，即：

式中：r為反應(yīng)速率/（μg/（mL·min））；rmax為最大反應(yīng)速率/（μg/（mL·min））；Km為米氏常數(shù)/（μg/mL）；Cs為底物質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

圖9 Lineweaver-Burk作圖法繪制米氏方程曲線Fig. 9 Lineweaver-Burk double reciprocal plot of Michaelis-Menten equation

如圖9所示，Lineweaver-Burk作圖法所得米渣蛋白、酪蛋白及牛血清蛋白3 種底物的線性回歸方程分別為：y=0.305 8x＋0.024 5（R2=0.929 1），y=0.283 6x＋0.019 2（R2=0.925 9），y=0.357 0x＋0.025 0（R2=0.935 3）。據(jù)方程求得米渣蛋白、酪蛋白及牛血清蛋白的Km值分別為14.77、12.48、20.05 mg/mL。Km與底物催化效率有關(guān)，Km值越小，反應(yīng)特異性越高，反應(yīng)動力、反應(yīng)速率和產(chǎn)物積累越高。M. anka蛋白酶對于酪蛋白和米渣蛋白具有較好的親和性，而對牛血清蛋白的親和性較差，與黑曲霉SL2-111菌株酸性蛋白酶具有結(jié)果的相似性[31]。這可能與底物特性和蛋白酶的肽鍵選擇性有密切聯(lián)系，酪蛋白是典型的疏水性蛋白，含有較高比例的脯氨酸和亮氨酸，而牛血清蛋白是一種親水性蛋白，其肽鏈中疏水性氨基酸的比例相對較低。說明這種酸性蛋白酶對疏水氨基酸構(gòu)成的肽鍵都有很強的切割能力[32]。

3 討論與結(jié)論

已有研究結(jié)果顯示，固體制曲培養(yǎng)M. anka CICC 40806，每克成曲酸性蛋白酶活力達到1 300 U。同樣實驗條件下利用米曲霉HN3.042制曲，每克成曲酸性蛋白酶活力約600 U，而中性和堿性蛋白酶分別約為1400 U和600 U[29]，米曲霉HN3.042具有很強的蛋白酶產(chǎn)生能力，但其酸性蛋白酶活力相對較低，比較可知，M. anka CICC 40806具有較強的分泌酸性蛋白酶能力，具有較好的研究和應(yīng)用價值。另一方面，底物對霉菌的酸性蛋白酶產(chǎn)生能力有明顯影響[30]，因此從酶的生產(chǎn)角度考慮，應(yīng)注意優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，而產(chǎn)酶培養(yǎng)底物的選擇性可能與蛋白酶作用的底物選擇性具有相關(guān)性。從M. anka CICC 40806的成曲中提取獲得粗酶液，再通過硫酸銨沉淀和CM Sepharose Fast Flow柱層析，經(jīng)兩步分離純化，得到比活力為70.89 U/mg的胞外酸性蛋白酶，SDS-PAGE結(jié)果顯示為一個主要蛋白質(zhì)條帶，說明酶基本達到電泳純，但仍然可見少量雜蛋白條帶，需要進一步優(yōu)化純化步驟。研究表明M. anka酸性蛋白酶適宜的pH值為3.0～4.0，在pH 3.0～7.0范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，酶的適宜反應(yīng)溫度為50 ℃，60 ℃時很快失活。M. anka酸性蛋白酶具有一定的耐鹽性，在低于4% NaCl的環(huán)境中相對酶活力高于20%。M. anka酸性蛋白酶對米渣蛋白和酪蛋白的催化效率較高，因此可能在米渣蛋白的發(fā)酵降解中發(fā)揮較好的作用。對M. anka胞外酸性蛋白酶的研究也為紅曲霉在高蛋白食品中的應(yīng)用提供了理論指導，關(guān)于其結(jié)構(gòu)和催化特異性等方面還有待于進一步研究。

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