剁辣椒中優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性分析

葉 陵，李 勇，王蓉蓉，劉成國，蔣立文，鄧放明，周 輝,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南省食品科學(xué)與生物技術(shù)重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.張家界靈潔綠色食品有限公司，湖南 張家界 427000）

我國是辣椒最大的生產(chǎn)國，辣椒的初加工主要有干制、腌制、油制、泡漬等，其中腌制辣椒包括剁辣椒、泡辣椒、辣椒醬等發(fā)酵辣椒產(chǎn)品。發(fā)酵是蔬菜的一種最簡單和方便的加工保存方法[1]，自然發(fā)酵辣椒主要是利用其天然辣椒表面附著的乳酸菌進行的發(fā)酵，經(jīng)過乳酸菌厭氧發(fā)酵以后，其味酸辣、可口，并且具有開胃的功能。

剁辣椒屬于發(fā)酵辣椒，其傳統(tǒng)加工方法是利用乳酸菌的自然發(fā)酵和食鹽保存作用進行加工處理，目前剁辣椒加工企業(yè)普遍采用20%以上的高鹽腌制辣椒的方法進行加工，這樣雖然可保留辣椒的色澤、辣味和脆度，但是產(chǎn)品沒有發(fā)酵辣椒特有的風(fēng)味和香氣，而且加工食用前要經(jīng)過脫鹽處理，這樣增加了生產(chǎn)成本，同時也造成了環(huán)境的污染。因此，選用安全、耐鹽、耐酸同時具有亞硝酸鹽降解能力的優(yōu)良乳酸菌進行辣椒的接種發(fā)酵，成為提高發(fā)酵辣椒品質(zhì)的重要途徑。

目前從剁辣椒中分離出的乳酸菌主要是植物乳桿菌、短乳桿菌、戊糖片球菌等，但以乳桿菌為主[2-6]，由于已有研究分離的剁辣椒樣本較少，分離出的乳酸菌數(shù)量少，分離乳桿菌的發(fā)酵產(chǎn)酸、降解亞硝酸鹽、耐鹽、耐酸及安全性等特性并未得到有效的評價。為充分了解剁辣椒中乳酸菌的上述特性，本研究首先從12 份剁辣椒樣品中分離出乳酸菌，利用產(chǎn)酸、亞硝酸鹽降解率等指標篩選出優(yōu)良的乳酸菌，對其進行鑒定，然后進行耐鹽、耐酸能力的比較，通過藥敏實驗初步考察分離乳酸菌的安全性。本研究將為剁辣椒發(fā)酵劑的開發(fā)利用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

自然發(fā)酵剁辣椒為食品微生物實驗室自制。

MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母浸粉5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫-80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸錳0.25 g、瓊脂15.0 g、水1 L，pH 6.4；在MRS培養(yǎng)基中分別加入不同終含量的NaCl及NaNO2，用于菌株的特性研究。

藥敏片 杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9272BS-III生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；TGL-20M離心機 長沙英泰儀器有限公司；雷磁pHs-3C pH計 上海精科實業(yè)有限公司；1510型全波長酶標儀 賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 剁辣椒中乳酸菌的分離、純化

稱取25 g自然發(fā)酵剁辣椒，放置于225 mL無菌生理鹽水中，搖勻，制備系列稀釋溶液，選取合適稀釋度的稀釋液，移取0.1 mL涂布于MRS固體平皿中，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取平板表面的單菌落至MRS平板上進行劃線純化，純化得到的單菌落進行保存。

1.3.2 菌株產(chǎn)酸分析

將純化后的單菌落接種于5 mL的MRS培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)24 h，利用酶標儀檢測菌液在波長600 nm處的光密度值OD600nm，利用pH計測試各菌株發(fā)酵液的最終pH值。

1.3.3 菌株亞硝酸鹽降解率測定

將在MRS培養(yǎng)液中活化后的菌株，以2%接種量接種于含有150 μg/mL NaNO2的MRS培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)24 h，測定培養(yǎng)前后培養(yǎng)液中NaNO2含量，計算培養(yǎng)液中亞硝酸鹽降解率。

1.3.4 亞硝酸鹽含量的測定

采用GB/T 5009.33—2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中鹽酸萘乙二胺分光光度法[7]。

1.3.5 篩選菌株的生理生化鑒定

生理生化實驗包括：產(chǎn)酸產(chǎn)氣實驗、精氨酸產(chǎn)氨實驗、淀粉水解實驗、明膠液化實驗、硫化氫實驗、碳源利用實驗等[8-9]。

1.3.6 分子生物學(xué)鑒定

乳酸菌基因組DNA的提?。喊凑仗旄萍加邢蓿ū本┯邢薰炯毦蚪MDNA提取試劑盒說明書進行。

16S rDNA的聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增：PCR擴增引物分別為：正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物1541R：5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’。

引物的合成和PCR產(chǎn)物的測序由華大基因完成。PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30次循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。測定后的16S rDNA序列登陸NCBI進行BLAST比對。

1.3.7 篩選菌株的生長曲線

將活化12 h后的菌液按1%的接種量轉(zhuǎn)接至MRS液體培養(yǎng)基中，同時以不接種的MRS液體培養(yǎng)基作為空白對照，于37 ℃恒溫培養(yǎng)，分別在2、4、6、8、10、12、24、36、48 h時將培養(yǎng)管取出，測定各菌株的OD600nm值，記錄測量結(jié)果。以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600nm值為縱坐標，繪制各菌株生長曲線。

1.3.8 篩選菌株的耐鹽能力比較

將初篩篩選出的乳桿菌活化后分別接種于含6%、9% NaCl的MRS培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)，每隔2 h測定菌液OD600nm值。以培養(yǎng)時間為橫坐標，菌液OD600nm為縱坐標，繪制曲線。

1.3.9 篩選菌株的耐酸能力比較

將初篩篩選出的乳桿菌活化后分別接種于pH 3和pH 5的MRS培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)，每隔2 h測定菌液OD600nm值。以培養(yǎng)時間為橫坐標，菌液OD600nm為縱坐標，繪制曲線。

1.3.10 藥敏實驗

采用紅霉素（15 μg/片）、四環(huán)素（40 μg/片）、慶大霉素（10 μg/片）、青霉素（10 μg/片）、氨芐西林 （10 μg/片）對篩選菌株進行藥敏實驗（紅霉素、氨芐西林、慶大霉素、四環(huán)素、青霉素）[10-11]。將活化后的篩選菌株以體積分數(shù)2%接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)4～6 h（OD600nm=0.5），取0.1 mL涂布于MRS平板上，取抗生素藥片，輕輕置于MRS平板表面。平板置于37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察抗生素藥片周圍是否出現(xiàn)抑菌圈。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析及數(shù)據(jù)繪圖，均采用Origin 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的產(chǎn)酸能力比較

通過鏡檢與過氧化氫酶實驗，共從12 份自然發(fā)酵剁辣椒中分離出28 株乳酸菌。通過比較28 株乳酸菌培養(yǎng)24 h發(fā)酵液的OD600nm值和pH值，比較不同菌株的生長能力和產(chǎn)酸能力，實驗結(jié)果如表1所示。

表1 不同菌株的OD600 nm值和pH值比較Table 1 Comparison of OD600 nm and pH values of cultures of 28 isolates

根據(jù)表1可知，分離的28 株乳酸菌，通過24 h的培養(yǎng)，OD600nm的范圍集中在0.37～1.68，最終pH值的范圍集中在4.01～5.56之間，其中W-2、W-4、Y-5、Y-12、Y-14、Y-17、Y-18、Y-25、Y-27、Y-28、Y-29、Y-31這12 株菌的OD600nm值在1.00以上，最終pH值在4.5以下，呈酸性，選擇這12 株菌進行亞硝酸鹽降解實驗。

2.2 亞硝酸鹽降解率比較

將初篩后的12 株菌接種至含NaNO2的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。亞硝酸鹽降解率結(jié)果見表2。

由表2可知，除了Y-14菌以外，其余復(fù)篩的11 株乳酸菌，對于150 mg/L NaNO2的亞硝酸鹽降解率都在90%以上，選擇降解率在96%以上的W-4、Y-5、Y-12、Y-25、Y-31這5 株菌進行鑒定。

表2 初篩菌株的復(fù)篩結(jié)果Table 2 Comparison of OD600 nm and pH values of 12 of the 28 isolates

2.3 分離菌株的鑒定

表3 分離菌株的發(fā)酵特性Table 3 Fermentation characteristics of 5 selected strains

參考《伯杰細菌手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12-13]，結(jié)合表3結(jié)果，初步鑒定分離菌株Y-5、Y-12、W-4與植物乳桿菌（L. plantarum）鑒定特征接近，分離菌株Y-25和Y-31與短乳桿菌（L. brevis）鑒定特征相接近。

分別提取Y-5、Y-12、Y-25、Y-31、W-4的基因組DNA后，用16S rDNA通用引物進行PCR擴增，擴增得到的片段大小在1.5 kb左右（圖1）。

將PCR產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果登錄NCBI網(wǎng)站，進行BLAST序列比對，發(fā)現(xiàn)Y-5、Y-12、W-4與植物乳桿菌的16S rDNA同源性達99%以上（圖2），結(jié)合生理生化實驗的結(jié)果，可判定Y-5、Y-12、W-4這3 株菌為植物乳桿菌。Y-25、Y-31的16S rDNA序列與短乳桿菌的同源性達99%以上，結(jié)合生理生化實驗結(jié)果，可以判定Y-25、Y-31為短乳桿菌。

圖1 16S rDNA擴增結(jié)果Fig. 1 PCR amplification of 16S rDNA

圖2 基于篩選菌株16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of isolated strains

2.4 乳桿菌的生長曲線

圖3 分離菌株的生長曲線Fig. 3 Growth curves of five isolated strains

將W-4、Y-5、Y-12、Y-25、Y-31這5 株菌活化后轉(zhuǎn)接至MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)。由圖3可以看出，5 株菌的生長情況基本相似。在培養(yǎng)至約6 h時進入對數(shù)生長期，在15 h時進入平臺期。

2.5 乳桿菌耐鹽能力比較

將W-4、Y-5、Y-12、Y-25、Y-31這5 株菌活化后轉(zhuǎn)接至含鹽量分別為6%、9%的MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)。

圖4 分離菌株在6% NaCl脅迫下的生長情況Fig. 4 Growth curves of five strains under osmotic stress with 6% NaCl

從圖4可以看出，在6% NaCl的滲透壓脅迫下，5 株菌的生長均出現(xiàn)不同程度的抑制。W-4、Y-5、Y-12這3 株植物乳桿菌，在培養(yǎng)3 h后相繼進入對數(shù)生長期，較圖3中生長曲線提早進入對數(shù)生長期，可能的原因是接種時所用的活化菌株不是處于同一生長階段，致使生長延遲期不一致，但滲透壓脅迫下的對數(shù)生長期細胞增長數(shù)量明顯低于正常狀態(tài)下生長數(shù)量。Y-25、Y-31這兩株短乳桿菌在前12 h內(nèi)基本沒有生長，培養(yǎng)24 h后OD600nm值才達到0.8左右。

圖5 分離菌株在9% NaCl脅迫下的生長情況Fig. 5 Growth curves of five strains under osmotic stress with 9% NaCl

從圖5可看出，9% NaCl的滲透壓脅迫下，植物乳桿菌W-4在培養(yǎng)6 h后進入對數(shù)生長期，其他4株乳酸菌在培養(yǎng)的12 h內(nèi)基本沒有生長，而短乳桿菌在培養(yǎng)24 h后OD600nm值基本沒有變化，說明短乳桿菌的生長受到強烈抑制。由此可見，植物乳桿菌相比較于短乳桿菌，具有更強的抗?jié)B透壓脅迫能力，其中植物乳桿菌W-4的抗?jié)B透壓能力最強。

2.6 乳桿菌耐酸能力比較

將W-4、Y-5、Y-12、Y-25、Y-31這5 株菌活化后分別轉(zhuǎn)接至pH 3和pH 5的MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)。從圖6可以看出，在pH 5條件下，5 株菌的生長情況基本一樣，在培養(yǎng)至6 h時進入對數(shù)生長期，而在培養(yǎng)12 h時，W-4、Y-5、Y-31這3 株菌的OD600nm值已經(jīng)高于另外兩株菌。在培養(yǎng)24 h后，5 株菌的OD600nm值基本接近，在1.5左右。

圖6 分離菌株在pH 5酸性脅迫下的生長情況Fig. 6 Growth curves of 5 strains under acidic stress with pH 5

而在pH 3條件下，5 株菌的生長受到明顯的抑制，沒有明顯的對數(shù)生長期，生長較為緩慢（圖7）。相比較其他菌株，植物乳桿菌W-4的生長受到的抑制作用最小。

圖7 分離菌株在pH 3酸性脅迫下的生長情況Fig. 7 Growth curves of 5 strains under acidic stress with pH 3

2.7 乳桿菌藥敏實驗結(jié)果

藥敏實驗證實W-4、Y-5、Y-12、Y-25、Y-31這5 株菌對測試的5 種抗生素均敏感，圖8為W-4藥敏實驗的結(jié)果，出現(xiàn)抑菌圈說明該菌株對測試的5 種抗生素敏感。

圖8 植物乳桿菌W-4對抗生素的敏感性Fig. 8 Antibiotic susceptibility of L. plantarum W-4

3 討 論

辣椒是世界上消費量最大的蔬菜之一，而且辣椒富含VC、多酚、黃酮、辣椒素等活性成分，因此具有很強的抗氧化能力[14-16]。剁辣椒品質(zhì)的形成與乳酸菌的作用密不可分。本研究從自然發(fā)酵剁辣椒中分離出乳酸菌，利用產(chǎn)酸、亞硝酸鹽降解率等指標篩選出優(yōu)良的乳酸菌，經(jīng)生理生化與分子生物學(xué)鑒定，分離菌株為植物乳桿菌和短乳桿菌，這與前人的研究結(jié)果一致。

植物乳桿菌是一種適應(yīng)能力較強的乳酸菌，在很多發(fā)酵食品中都有它的身影。如乳制品、發(fā)酵蔬菜、發(fā)酵肉制品等，而且植物乳桿菌在人和動物的腸道中也能進行定殖[17-18]。植物乳桿菌常見于發(fā)酵黃瓜、番茄、茄子等果蔬中[19-21]，其中有一些植物乳桿菌具有較強的亞硝酸鹽降解能力[22]。耐鹽能力對于植物乳桿菌在高鹽條件下進行發(fā)酵具有重要的意義，決定著植物乳桿菌能否快速成為發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌[23-24]。本研究證實植物乳桿菌比短乳桿菌具有更強的耐脅迫能力，這與植物乳桿菌具有強大的環(huán)境適應(yīng)能力有關(guān)，例如植物乳桿菌具有較多的植物多酚降解基因[25-26]，同時植物乳桿菌具有過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶等合成能力，具有較強的抵御不良環(huán)境能力[27-28]。在蔬菜自然發(fā)酵過程中，主要利用蔬菜表面附著的乳酸菌啟動乳酸發(fā)酵的過程，這些來源于環(huán)境中乳酸菌的安全性也受到了關(guān)注，有研究報道指出泡菜原料表面多種乳酸菌對抗生素存在一定的抗性[29-30]。而植物乳桿菌是一致公認為安全的乳酸菌，國家衛(wèi)生部明文規(guī)定可以添加在食品中，下一步工作將研究植物乳桿菌接種發(fā)酵剁辣椒的工藝，以及進一步闡明植物乳桿菌在剁辣椒品質(zhì)形成中的作用機制。

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