橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物的制備及其理化性質(zhì)分析

曹汝鴿，趙亞麗，周中凱*

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

橙皮苷又名橙皮苷、柑果苷，是由一分子橙皮素與一分子的二糖縮水結(jié)合而成，屬于雙氫黃酮類化合物，廣泛存在于柑橘類和中草藥（如陳皮、枳實(shí)等）中，是橙皮中最主要的類黃酮化合物[1-4]，具有抗氧化、預(yù)防癌癥、降低血管脆性和人體膽固醇含量等功效，是治療心血管疾病的重要藥物原料[5-6]。但由于橙皮苷難溶于水，使得它在功能性食品以及制藥等領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制[7]。殼寡糖是一種來源豐富的天然高分子，是天然糖類中唯一帶正電的堿性氨基多糖，具有抗氧化、抑菌、預(yù)防糖尿病、抗腫瘤等多種生物活性作用[8-11]。

多酚和多糖可以發(fā)生非共價(jià)或共價(jià)的相互作用，且多糖可以促進(jìn)多酚的抗氧化能力[12]。王麗穎等[13]通過對多糖與多酚相互作用機(jī)制研究得出，多糖能夠增強(qiáng)多酚的抗氧化、降血糖、預(yù)防心血管疾病、抗凝血等生物活性，并影響多酚生物利用率，改善食品品質(zhì)。張曼等[14]對多糖和多酚形成的絡(luò)合物進(jìn)行研究得出，多糖和多酚形成的絡(luò)合物對食品品質(zhì)有影響，能夠改善食品風(fēng)味以及營養(yǎng)價(jià)值，抑制氧化和褐變等。白海娜等[15]對多酚類化合物與黑木耳多糖的復(fù)配物進(jìn)行研究得出，多酚類化合物與黑木耳多糖具有協(xié)同抗氧化的作用。

目前利用殼寡糖改善橙皮苷溶解性的研究鮮見報(bào)道。為探索利用天然多糖改變天然多酚，探索兩者之間的相互作用，促進(jìn)天然產(chǎn)物在各個領(lǐng)域的利用率，將殼寡糖作為一種增加多酚溶解性的載體，采用噴霧干燥法將橙皮苷與殼寡糖結(jié)合，制取了一種新的橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物。并利用掃描電子顯微鏡、紅外光譜、熱重、核磁共振等技術(shù)研究該復(fù)合物的理化性質(zhì)。從分子結(jié)構(gòu)層面研究橙皮苷和殼寡糖分子之間的相互作用機(jī)理，從而探索殼寡糖對橙皮苷溶解性的改善機(jī)理，并對橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物的抗氧化活性進(jìn)行評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橙皮苷（分子質(zhì)量610.5 Da） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；殼寡糖（分子質(zhì)量980 Da） 浙江金殼藥業(yè)有限公司；2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tris-(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ）、水溶性VE（Trolox）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；甲酸、甲醇、無水乙醇（均為分析純） 天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；重水（D2O） 上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YC-015實(shí)驗(yàn)型噴霧干燥機(jī) 上海雅程儀器設(shè)備有限公司；TGL-16A型高速冷凍離心機(jī) 長沙平凡儀器有限公司；XW-80微型渦流混合儀 上海滬西分析儀器有限公司；TS50傅里葉變換近紅外光譜儀 美國Thermo Fisher公司；SU510掃描電子顯微鏡 日本日立公司；TGA-Q50熱重分析儀 美國TA儀器；400 MHz核磁共振波譜儀 德國布魯克科技有限公司；高效液相色譜儀日本安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物的制備

用蒸餾水分別配制2 mmol/L的橙皮苷溶液和2 mmol/L的殼寡糖溶液，將兩者等體積混合。將混合液在渦旋振蕩器上振蕩5 min，20 ℃、1 000×g離心10 min后取上清液，進(jìn)行噴霧干燥（進(jìn)風(fēng)溫度100 ℃，流速1 L/h），最終制得橙皮苷和殼寡糖物質(zhì)的量比為1∶1的復(fù)合物，為復(fù)合物A。按照上述方法分別制得物質(zhì)的量比為1∶5和1∶10的橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物，分別為復(fù)合物B和C。

1.3.2 高效液相色譜分析

分別將橙皮苷及橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物溶于超純水中，渦旋振蕩5 min后，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，采用高效液相色譜儀測定橙皮苷含量。色譜柱：Xterra RP18柱（250 mm×4.6 mm）；流動相：溶劑A：0.1%甲酸溶液，溶劑B：甲醇溶液（含0.1%甲酸）；梯度洗脫（0～20 min，100% A～100% B），進(jìn)樣量為20 μL，流速為0.2 mL/min，檢測波長為285 nm[7]。通過橙皮苷的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算橙皮苷的含量。

1.3.3 掃描電子顯微鏡分析

將導(dǎo)電膠黏于銅板上，分別取適量的純橙皮苷、純殼寡糖、橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物均勻涂布在導(dǎo)電膠上，然后用常規(guī)真空噴鍍法噴金90 s后，將銅板置于掃描電子顯微鏡下分別對樣品進(jìn)行顯微拍攝。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜分析

取適量的純橙皮苷、純殼寡糖、橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物，分別用溴化鉀壓片后，置于傅里葉紅外光譜儀中記錄其紅外光譜。

1.3.5 熱重分析

準(zhǔn)確稱取適量的樣品，放入熱重分析儀中對樣品進(jìn)行分析，升溫速率為10 ℃，測試溫度范圍為50～600 ℃，N2為保護(hù)氣。用計(jì)算機(jī)自動記錄樣品的質(zhì)量保留率、質(zhì)量變化率曲線。其中，質(zhì)量變化率曲線是熱重分析的一次微分曲線。

1.3.6 核磁共振氫譜分析

分別將純橙皮苷、橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物A、B、C，溶于重水，采用核磁共振波譜儀分析橙皮苷及其復(fù)合物的1H核磁共振光譜。核磁共振光譜獲得的單脈沖序列參數(shù)設(shè)置如下[5]：取樣時(shí)間2.18 s，掃描次數(shù)16 次、延遲時(shí)間15 s，采樣溫度為25 ℃，其他參數(shù)為儀器內(nèi)設(shè)值。

1.3.7 抗氧化活性分析

1.3.7.1 DPPH自由基清除率的測定

參考Xu Baojun[16]和Thaipong[17]等報(bào)道的方法并稍作調(diào)整。取測定液0.5 mL，加入2 mL 2×10－4mol/L DPPH溶液，再加入2.5 mL無水甲醇，充分混合，避光靜置30 min，于517 nm波長處測定其吸光度A1。同時(shí)測定2 mL 2×10－4mol/L DPPH溶液與3 mL無水甲醇混合液的吸光度A2，以及0.5 mL測定液與4.5 mL無水甲醇混合液的吸光度A0。按照公式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率：

式中：A0為樣液＋無水甲醇混合液吸光度；A1為樣液＋DPPH溶液＋無水甲醇吸光度；A2為DPPH溶液＋無水甲醇吸光度。

1.3.7.2 ABTS＋·清除率的測定

參考Xu Baojun[16]和Thaipong[17]等報(bào)道的方法并稍作調(diào)整。7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液以體積比2∶1混合，在室溫下置于暗處反應(yīng)16 h，形成ABTS儲備液。ABTS儲備液使用前用無水乙醇稀釋成工作液，要求30 ℃、734 nm波長下的吸光度為0.70±0.02。取樣液0.2 mL，加入5 mL ABTS工作液，充分混合，室溫下反應(yīng)10 min，于734 nm波長處測定其吸光度A1。以無水乙醇代替樣液、ABTS工作液作空白、對照。按照公式（2）計(jì)算ABTS自由基清除率：

式中：A0為樣液的吸光度；A1為ABTS工作液＋樣液的吸光度；A2為ABTS工作液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

高效液相色譜和抗氧化能力分析均做3 次平行實(shí)驗(yàn)。采用SPSS 19軟件對抗氧化能力分析結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用ANOVA進(jìn)行Duncan差異分析，P小于0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜分析結(jié)果

圖1 橙皮苷及橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物水溶性對比圖Fig. 1 Water solubility of hesperidin and Hesp-COS

通過研究證明，高效液相色譜法測定橙皮苷的含量具有重復(fù)性及穩(wěn)定性好，實(shí)驗(yàn)簡單安全，是橙皮苷含量檢測的有效方法[18]。以高效液相色譜圖中橙皮苷的峰面積為1，橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物的峰面積相對于橙皮苷峰面積值為相對峰面積。由圖1可知，將殼寡糖加入橙皮苷中大大增加了橙皮苷在水中的溶解度（物質(zhì)的量比1∶1、1∶5、1∶10復(fù)合物中橙皮苷溶解度分別是純橙皮苷的1.6、2.7、3.8 倍），并且隨著殼寡糖比例的增大，橙皮苷的溶解度也變大。橙皮苷溶解度增大的一個主要原因是由于殼寡糖打亂橙皮苷原有的結(jié)晶，使其自身結(jié)晶度降低[19]，說明橙皮苷和殼寡糖發(fā)生了相互作用，殼寡糖可以顯著增加橙皮苷在水中的溶解性。

2.2 掃描電子顯微鏡分析結(jié)果

圖2 橙皮苷、殼寡糖及橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物的掃描電子顯微鏡圖Fig. 2 Scanning electron micrographs of hesperidin, chitosan and Hesp-COS complex

由圖2可以發(fā)現(xiàn)，橙皮苷顆粒呈現(xiàn)針狀結(jié)晶凝集而成的球狀結(jié)構(gòu)，殼寡糖顆粒呈實(shí)心的球狀結(jié)構(gòu)，而橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物均呈明顯的片狀結(jié)構(gòu)，其形態(tài)與橙皮苷、殼寡糖的電子顯微鏡外觀相比發(fā)生明顯變化。說明在噴霧干燥過程中，橙皮苷-殼寡糖相互結(jié)合形成新的物質(zhì)。

2.3 紅外光譜掃描分析結(jié)果

圖3 橙皮苷、橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物的紅外光譜圖Fig. 3 FTIR spectra of hesperidin and Hesp-COS complex

由圖3可知，與橙皮苷相比，橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物在3 423.7 cm－1位置出現(xiàn)的—OH特征吸收峰有所增強(qiáng)，在2 935 cm－1位置出現(xiàn)的C—H的特征吸收峰有所增強(qiáng)；復(fù)合物在1 276.82、1 205 cm－1位置出現(xiàn)的芳香醚基（＝C—O—C）的特征吸收峰有所減弱；1 095、1 069 cm－1位置的甲氧基吸收峰有所增強(qiáng)。橙皮苷的紅外圖譜具有酚羥基（3 478 cm－1）、苯環(huán)（1 445、1 520、1 470、1 607 cm－1）、芳香醚基（1 276.82、1 205 cm－1）、羰基（1 649 cm－1）的特征吸收峰[20]，而在復(fù)合物中這些特征峰消失不見。橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物的紅外光譜發(fā)生明顯變化，而不同比例的橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物之間紅外光譜并沒有太大的變化。橙皮苷的紅外光譜吸收峰強(qiáng)度發(fā)生變化甚至消失，與芳香醚基的拉伸與變形有關(guān)[21]，說明橙皮苷和殼寡糖發(fā)生了分子間的相互作用，生成新的復(fù)合物，使得復(fù)合物具有與橙皮苷不同的紅外吸收峰譜[22-23]。

2.4 核磁共振氫譜分析結(jié)果

用核磁共振氫譜技術(shù)分析橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物[7]見圖4，復(fù)合物中橙皮苷產(chǎn)生的化學(xué)位移變化值Δδ為純橙皮苷質(zhì)子的化學(xué)位移減去復(fù)合物中橙皮苷的化學(xué)位移。由表1可知，隨著復(fù)合物中殼寡糖物質(zhì)的量比的增加，橙皮苷中質(zhì)子H2’，5’，6’（δ?0.018～0.033）；H6，H8（δ?0.007～0.044）和H2（δ?0.010～0.041）的化學(xué)位移變化值Δδ也在增大，這是由于橙皮苷和殼寡糖分子之間相互靠近，從而改變了橙皮苷質(zhì)子在磁場中的環(huán)境而引起的。從Δδ值可推斷，橙皮苷中H6、H8所在的A環(huán)、H2所在的C環(huán)比H2’，5’，6’所在的B環(huán)更加接近殼寡糖分子。在復(fù)合物的核磁共振氫譜中并沒有觀察到橙皮苷其他質(zhì)子發(fā)生明顯的化學(xué)位移變化，這說明橙皮苷糖基部分和殼寡糖分子之間沒有相互靠近關(guān)系。多酚和多糖的相互作用是由于氫鍵和羥基之間的相互作用，由核磁共振結(jié)果分析可知，橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物的穩(wěn)定性主要靠橙皮苷芳香環(huán)上的羥基（—OH）和殼寡糖的羥基（—OH）來進(jìn)行維系[24-25]。

圖4 橙皮苷、橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物的核磁共振氫譜Fig. 4 1H-NMR spectra of hesperidin and Hesp-COS complex

表1 橙皮苷質(zhì)子在橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物中化學(xué)位移變化值（Δδ）Table 1 Chemical shift changes (Δδ) of protons in Hesp-COS complex

2.5 熱重分析結(jié)果

圖5 橙皮苷、橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物的熱重分析曲線Fig. 5 Thermogravimetric analysis of hesperidin and Hesp-COS complex

圖6 橙皮苷、橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物的質(zhì)量變化率曲線Fig. 6 Different thermal gravity curves of hesperidin and Hesp-COS complex

從圖5可以看出，純橙皮苷在266～500 ℃范圍內(nèi)質(zhì)量損失61.10%，這是由于橙皮苷受熱分解。而橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物在266～500 ℃的質(zhì)量損失是由于橙皮苷與殼寡糖形成的復(fù)合物發(fā)生熱分解，裂解為橙皮苷和殼寡糖。在橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物的質(zhì)量變化率曲線（圖6）的峰值167 ℃處，復(fù)合物A、B、C質(zhì)量損失率（圖5）分別為6.7%、13.11%、13.59%。即隨著復(fù)合物中殼寡糖比例的增加，在該溫度下復(fù)合物的熱穩(wěn)定性下降，這是由于橙皮苷和殼寡糖分子間的氫鍵作用力受熱穩(wěn)定性下降所造成的，由復(fù)合物裂解出來橙皮苷或殼寡糖分子進(jìn)一步分解造成該溫度下復(fù)合物的質(zhì)量損失加大，進(jìn)一步證明橙皮苷和殼寡糖之間存在非共價(jià)鍵作用，形成了復(fù)合物[8,22]。

2.6 抗氧化分析結(jié)果

表2 橙皮苷、殼寡糖及橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物的抗氧化能力Table 2 Free radical scavenging capacity of hesperidin,chitooligosaccharide and Hesp-COS complex

由表2所示，橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物對DPPH自由基清除率（86.02%～94.38%）與橙皮苷對DPPH自由基清除率（83.72%）相比有所增加，復(fù)合物對ABTS＋·清除率（12.81%～17.37%）與橙皮苷（9.15%）對ABTS＋·清除率顯著提高，并隨著殼寡糖比例的增加，復(fù)合物對自由基清除能力有所提高。有研究表明，黃酮類化合物的抗氧化能力與其結(jié)構(gòu)有直接關(guān)系[26-27]，橙皮苷的抗氧化能力高，并且與其他在A和C環(huán)中提供兒茶酚樣結(jié)構(gòu)的5-OH和4-keto的類黃酮相當(dāng)[28]；酚羥基基團(tuán)可以增強(qiáng)或減弱抗氧化劑對自由基的反應(yīng)活性，氫鍵對抗氧化劑清除自由基能力的強(qiáng)弱取決于從反應(yīng)物到中間過渡態(tài)時(shí)氫鍵帶來的穩(wěn)定性的強(qiáng)弱[29]。說明橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物中橙皮苷的結(jié)合位點(diǎn)A、C環(huán)發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化使得復(fù)合物抗氧化能力有所提高。并且，復(fù)合物的抗氧化能力相比殼寡糖要弱，從另一方面也說明復(fù)合物的抗氧化能力的提高可能是由于復(fù)合物中新引入的殼寡糖中親水羥基基團(tuán)的緣故[30]。

3 結(jié) 論

橙皮苷來源廣泛，是天然的抗氧化劑，在功能性食品及醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，改善橙皮苷的水溶性對增加其生物利用率和擴(kuò)展其應(yīng)用具有重大的研究意義。本實(shí)驗(yàn)采用噴霧干燥的方法制備橙皮苷-殼寡糖復(fù)合物，并采用掃描電子顯微鏡、紅外光譜、熱重等分析技術(shù)對該復(fù)合物的理化性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明橙皮苷與殼寡糖通過氫鍵或范德華力的非共價(jià)鍵作用形成了穩(wěn)定的復(fù)合物。經(jīng)高效液相色譜法分析可知，復(fù)合物使得橙皮苷在水中的溶解度得到顯著提高，并且復(fù)合物對自由基的清除作用大大增強(qiáng)。這為橙皮苷在功能性食品，醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的創(chuàng)新性應(yīng)用提供了新的思路。

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