β-欖香烯誘導人結腸癌細胞DLD-1的增殖抑制和凋亡研究

汪國玉，張 蕾，耿亞迪，馮曉俊，陳昭琳，趙曉曉，姜 玲,，魏 偉

欖香烯是從傳統(tǒng)中藥姜黃屬溫郁金中提取分離的一種新型抗腫瘤藥物，β-欖香烯是其主要成分，占60%～72%[1]。到目前為止，β-欖香烯作為一種非細胞毒性抗腫瘤藥物，臨床上已經(jīng)用于腦癌、乳腺癌及肝癌等一些腫瘤的治療[2]。結腸癌是一種常見的惡性腫瘤，在我國男女發(fā)病率和死亡率呈顯著上升趨勢，且多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已屬于中晚期[3]。目前結腸癌的治療多以手術為主，5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑等化療和放療為輔，但會出現(xiàn)惡心嘔吐、脫發(fā)、免疫功能下降等副作用，且患者容易復發(fā)，因此急需有效低毒的抗腫瘤藥物治療結腸癌[4]。有研究[5-6]表明β-欖香烯對結腸癌HT-29細胞和Lovo細胞有抑制增殖作用，但具體作用特點和機制尚未提及。故該研究旨在觀察β-欖香烯對結腸癌細胞DLD-1增殖及凋亡的影響，并初步探討β-欖香烯對DLD-1細胞活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)生成的影響。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑β-欖香烯(大連金港制藥有限公司)；CellTiter 96?AQueous單溶液細胞增殖檢測試劑盒(MTS)(普洛麥格北京生物技術有限公司)；Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒(貝博生物有限公司)；Hoechst 33342活細胞染色液(100×)、活性氧檢測試劑盒(DCFH-DA)、Western及IP細胞裂解液、PMSF(100 mmol/L)、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)；凋亡抗體套盒(美國Cell Signaling Technology公司)；辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2細胞培養(yǎng)DLD-1細胞由安徽醫(yī)科大學藥學院細胞庫饋贈，復蘇后加入含10%胎牛血清、20 U/ml的青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長至80%～90%時用胰酶消化進行傳代，細胞傳3代穩(wěn)定后采用狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞進行實驗操作。

1.3MTS法檢測細胞活力胰酶消化處于對數(shù)生長期的DLD-1細胞并制成單細胞懸液，以每孔5×103個細胞接種至96孔板中，每孔200 μl，當細胞長至50%～60%時依序加入不同濃度β-欖香烯(25、50、100、200、300、400、500、600 μmol/L)作為藥物組，設一個空白對照組，每組設6個復孔。分別處理24、48、72 h后，顯微鏡觀察細胞生長狀況。相應時間后每孔加入MTS/PMS混合物40 μl，1 h后于490 nm波長下測定各孔吸光度( optical density，OD)值。結果以細胞活力大小表示，細胞活力(%)=藥物組OD / 空白對照組OD ×100%。

1.4克隆形成實驗取對數(shù)生長期DLD-1細胞接種到6孔板中，每孔2 ml，1×103個細胞；待細胞貼壁后每孔依次加入不同濃度β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)作為藥物組，設一個空白對照組。24 h后吸棄藥液，每孔加入2 ml含10%胎牛血清、20 U/ml的青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d換液1次。待長出細胞集落，14 d后處理。PBS清洗細胞2次，每孔加入1 ml多聚甲醛固定液固定30 min后吸棄，加入1 ml過濾的結晶紫染色液染色15 min，用清水輕輕沖掉結晶紫染色液，將6孔板殘余的水分晾干、拍照。

1.5Hoechst33342染色實驗取對數(shù)生長期DLD-1細胞接種到12孔板中，每孔1 ml，1×105個細胞；待細胞貼壁后每孔依次加入不同濃度β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)作為藥物組，設一個空白對照組。24 h后吸棄藥液，PBS清洗1次，每孔加入1 ml Hoechst 33342染色液，放入培養(yǎng)箱孵育15 min后吸棄，PBS清洗2次后于熒光顯微鏡下觀察。

1.6AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡取對數(shù)生長期DLD-1細胞接種到6孔板中，細胞密度為105個/ml。待細胞貼壁后依次加入不同濃度β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)作為藥物組，設一個空白對照組。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用不含EDTA的胰酶消化細胞，并進行細胞計數(shù)，取5×105個細胞進行Annexin V-FITC細胞凋亡檢測實驗。細胞收集后用冷PBS洗滌2次，離心后用400 μl 1× Annexin V結合液重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC進行染色，2～8 ℃避光孵育15 min，再加入10 μl PI染色液輕輕混勻，于2～8 ℃避光孵育5 min，用流式細胞儀進行檢測。

1.7Westernblot法檢測凋亡相關蛋白的表達β-欖香烯(100、200、300 μmol/L)及空白對照組處理DLD-1細胞24 h后，提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度并將蛋白調(diào)整為相同濃度。SDS-PAGE法將蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，兔抗人GAPDH(1 ∶1 000)、Cleaved PARP(1 ∶1 000)、PARP(1 ∶1 000)、Cleaved Caspase-9(1 ∶1 000)、Caspase-9(1 ∶1 000)、Cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)和Caspase-3(1 ∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，顯影。

1.8ROS檢測

1.8.1熒光顯微鏡觀察ROS水平 β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)及空白對照組處理DLD-1細胞24 h后，PBS清洗2次，每孔加入1 ml DCFH-DA熒光探針，放入培養(yǎng)箱孵育20 min，用無血清培養(yǎng)基清洗3次，去掉未進入細胞的DCFH-DA，熒光顯微鏡下觀察。

1.8.2流式細胞術檢測ROS水平 β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)及空白對照組處理DLD-1細胞24 h后，收集細胞于1.5 ml離心管，用PBS清洗2次離心，每管加入1 ml DCFH-DA熒光探針，吹打混勻放入培養(yǎng)箱孵育20 min，3 min顛倒混勻1次，用無血清培養(yǎng)基清洗3次，充分去掉未進入細胞的DCFH-DA，上機檢測。

2 結果

2.1β-欖香烯對DLD-1細胞活力的影響β-欖香烯(25、50、100、200、300、400、500、600 μmol/L)處理細胞24 h后，倒置顯微鏡下觀察，空白對照組細胞貼壁生長，呈不規(guī)則梭形、邊緣光滑；β-欖香烯藥物組隨著藥物濃度的升高，細胞存活數(shù)目減少、細胞間隙變大，細胞皺縮且形態(tài)模糊，見圖1。MTS法結果顯示，50～400 μmol/L β-欖香烯顯著抑制DLD-1細胞的活力(F=97.78、153.3、175.7，P<0.05，P<0.01)，見圖2。

圖1 β-欖香烯處理DLD-1細胞24 h后細胞形態(tài) ×200

圖2 β-欖香烯抑制DLD-1細胞增殖

2.2β-欖香烯對DLD-1細胞克隆形成能力的影響克隆形成實驗結果表明，β-欖香烯顯著抑制DLD-1細胞增殖。與空白對照組相比，隨著β-欖香烯濃度增大，細胞克隆數(shù)目變少，細胞集落數(shù)逐漸減少(F=337.9，P<0.01)，見圖3。

2.3β-欖香烯對DLD-1細胞核的影響β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)處理細胞24 h后進行Hoechst 33342染色，結果顯示細胞均出現(xiàn)藍染，空白對照組細胞核規(guī)則均勻，核膜完整，但藥物組隨著β-欖香烯濃度增加，部分細胞核成碎塊狀，核染色質固縮發(fā)生高亮呈現(xiàn)致密濃染(F=140.9，P<0.05，P<0.01)，見圖4。

2.4β-欖香烯對DLD-1細胞凋亡的影響采用β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)處理DLD-1細胞24 h后，與空白對照組相比，β-欖香烯給藥組的凋亡率增加(F=305.4，P<0.01)，表明當β-欖香烯濃度增大時，可以誘導DLD-1細胞出現(xiàn)凋亡，抑制細胞的生長，見圖5。

圖3 β-欖香烯對DLD-1細胞克隆形成能力的影響

圖4 Hoechst 33342染色實驗測定DLD-1細胞凋亡 ×200

圖5 β-欖香烯誘導DLD-1細胞凋亡

圖6 β-欖香烯對DLD-1細胞凋亡相關蛋白表達的影響

2.5β-欖香烯對DLD-1細胞凋亡相關蛋白表達的影響Western blot結果表明，β-欖香烯作用DLD-1細胞24 h后，Cleaved PARP、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3表達水平隨著β-欖香烯濃度增大而增加；PARP、Caspase-9和Caspase-3蛋白的表達水平變化不明顯(F=18.61、7.92、261.3、33.68、213.9、17.99，P<0.01)。提示β-欖香烯促進PARP、Caspase-9和Caspase-3蛋白剪切，促進了DLD-1細胞的凋亡，見圖6。

2.6DLD-1細胞內(nèi)ROS的表達熒光顯微鏡下觀察結果顯示，β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)作用于DLD-1細胞24 h后，與空白對照組相比，β-欖香烯藥物組DCF的熒光強度依次增加(F=279.7，P<0.01)，流式細胞儀檢測結果與熒光顯微鏡相一致(F=280.22，P<0.01)，表明β-欖香烯濃度增大使細胞內(nèi)ROS水平增加，見圖7、8。

圖7 熒光顯微鏡下觀察β-欖香烯對DLD-1細胞內(nèi)ROS的影響 ×100

圖8 流式細胞儀檢測β-欖香烯對DLD-1細胞內(nèi)ROS的影響

3 討論

姜黃屬植物莪術作為我國常用的傳統(tǒng)中藥，具有行氣止痛、積散結、破血祛瘀作用，《醫(yī)家心法》論“廣茂即莪術，凡行氣破血，消積散結皆用之”等。大量研究[7-8]表明莪術對多種腫瘤如乳腺癌、肝癌及胃癌等有很好的治療作用，β-欖香烯是從中藥莪術根莖中提取并分離的有效活性單體，其具有低毒有效、廣譜的性質，對多種腫瘤有明顯的抑制作用，是臨床上常用的抗腫瘤藥物。有研究[9]表明，β-欖香烯作為一種天然的抗血管生成劑，可以通過抑制VEGF介導的血管生成，抑制黑素瘤的生長和轉移。另外，β-欖香烯通過上調(diào)P53蛋白的表達促進外泌體的釋放，抑制人肺癌細胞的增殖[10]。在本研究中，MTS實驗和克隆形成實驗顯示，β-欖香烯能夠顯著抑制結腸癌DLD-1細胞的增殖。

在一定條件下，細胞受內(nèi)在遺傳機制的控制自動結束生命的過程稱之為細胞凋亡，其對多細胞生物體的胚胎發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)起著至關重要的作用[11]。當細胞發(fā)生凋亡時，細胞體積縮小，線粒體膜電位消失，核質濃縮，DNA降解，胞膜內(nèi)側外翻到膜表面，最終細胞被分割包裹為幾個凋亡小體，繼而被吞噬細胞吞噬[12]。在細胞凋亡過程中Caspases扮演著十分重要的角色，細胞凋亡過程其實就是Caspases不可逆有限水解底物的級聯(lián)放大反應過程。當細胞色素C進入細胞質后，募集Caspase-9前體并使其剪切活化，從而進一步激活效應Caspase-7和Caspase-3，而PARP是細胞凋亡核心元件Caspase-3 的切割底物，共同啟動Caspase級聯(lián)反應，最終引發(fā)細胞凋亡[13]。本研究探討了β-欖香烯誘導DLD-1細胞凋亡的初步機制。Hoechst 33342染色顯示β-欖香烯可使細胞出現(xiàn)細胞核聚縮和致密濃染的表現(xiàn)，Annexin V/PI雙染結果表明，β-欖香烯可誘導DLD-1細胞出現(xiàn)凋亡；Western blot結果表明β-欖香烯誘導DLD-1細胞凋亡與PARP、Caspase-3、Caspase-9的活化有關。以上說明β-欖香烯作為中藥有效活性成分能夠誘導結腸癌DLD-1細胞發(fā)生凋亡。

ROS作為一種自由基，與腫瘤之間的關系密切，越來越多的研究表明ROS不僅與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關，還和腫瘤的治療有著密切聯(lián)系。ROS在不同水平下會有不同的作用。低水平的ROS促進細胞分裂與增殖，中等水平的ROS導致細胞周期阻滯，而高水平的ROS誘導細胞發(fā)生凋亡或壞死[14]。許多抗癌藥物如烷化劑和喜樹堿等會通過介導ROS的大量釋放和線粒體膜電位的變化，激活Caspase-3 等蛋白酶來誘導癌細胞發(fā)生凋亡[15]。本研究觀察了β-欖香烯對ROS的影響，熒光顯微鏡下觀察和流式細胞儀檢測結果顯示β-欖香烯處理DLD-1細胞24 h后，隨著β-欖香烯作用濃度增加，藥物組細胞內(nèi)ROS 水平與空白對照組相比明顯增加，表明ROS可能在β-欖香烯抑制DLD-1細胞增殖及誘導凋亡中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，β-欖香烯抑制人結腸癌細胞DLD-1的增殖并誘導細胞凋亡，這可能與ROS升高及上調(diào)凋亡相關蛋白有關，為β-欖香烯應用于結腸癌的臨床治療提供了實驗依據(jù)。

參考文獻

[1] Zhang X, Li Y, Zhang Y, et al. Beta-elemene blocks epithelial-mesenchymal transition in human breast cancer cell line MCF-7 through Smad3-mediated down-regulation of nuclear transcription factors[J]. PLoS One, 2013,8(3):e58719.

[2] Guan C, Liu W, Yue Y, et al. Inhibitory effect of β-elemene on human breast cancer cells[J]. Int J Clin Exp Pathol,2014,7(7):3948-56.

[3] Chen W, Zheng R, Baade P D, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2):115-32.

[4] 孫 燕,顧 晉,汪建平，等.中國結直腸癌診療規(guī)范(2015版)[J]. 中華普通外科學文獻(電子版),2015,9(6):506-23.

[5] 蘇 影, 王成昆, 彭 波. β-欖香烯對HepG2和HT-29細胞體外抗癌作用的實驗研究[J]. 當代醫(yī)學(學術版),2008,14(18):1-3.

[6] 黃富春, 鄭 樹. 欖香烯乳對結腸癌Lovo細胞端粒酶活性、細胞凋亡及細胞周期的影響[J]. 醫(yī)藥導報,2004,23(10):712-4.

[7] Tan W, Lu J, Huang M, et al. Anti-cancer natural products isolated from chinese medicinal herbs[J]. Chinese Medicine, 2011,6(1):27.

[8] Ooko E, Kadioglu O, Greten H J, et al. Pharmacogenomic characterization and isobologram analysis of the combination of ascorbic acid and curcumin-two main metabolites of curcuma longa-in cancer cells[J]. Front Pharmacol,2017,8:38.

[9] Chen W,Lu Y,Wu J,et al. Beta-elemene inhibits melanoma growth and metastasisviasuppressing vascular endothelial growth factor-mediated angiogenesis[J]. Cancer Chemother Pharmacol,2011,67(4):799-808.

[10] Li J,Yu J,Liu A,et al. β-elemene against human lung cancerviaup-regulation of P53 protein expression to promote the release of exosome[J]. Lung Cancer,2014,86(2):144-50.

[11] Millimouno F M, Dong J, Yang L, et al. Targeting apoptosis pathways in cancer and perspectives with natural compounds from mother nature[J]. Cancer Prev Res (Phila), 2014,7(11):1081-107.

[12] Redza-Dutordoir M, Averill-Bates D A. Activation of apoptosis signalling pathways by reactive oxygen species[J]. Biochim Biophys Acta, 2016,1863(12):2977-92.

[13] Julien O, Wells J A. Caspases and their substrates[J]. Cell Death Differ, 2017,24(8):1380-9.

[14] Tong L, Chuang C C, Wu S, et al. Reactive oxygen species in redox cancer therapy[J]. Cancer Lett, 2015,367(1):18-25.

[15] Ozben T. Oxidative stress and apoptosis: impact on cancer therapy[J]. J Pharm Sci, 2007,96(9):2181-96.