口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中EGFR的表達(dá)和突變的意義及對(duì)預(yù)后的影響

劉海波，鄭維銀

口腔鱗癌的發(fā)生及發(fā)展是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜過(guò)程。隨著分子靶向藥物臨床應(yīng)用于治療頭頸部鱗癌(HNSCC)，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(EGFR)逐漸成為一個(gè)熱門(mén)靶點(diǎn)被國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究，近年來(lái)研究表明EGFR在血管生成、細(xì)胞增殖分化、腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起重要作用[1]。EGFR出現(xiàn)過(guò)表達(dá)可能跟腫瘤的分化、轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后、總生存期等因素相關(guān)，這對(duì)判斷術(shù)后癌癥的復(fù)發(fā)有重要意義[2]。定位于EGFR酪氨酸激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)的編碼區(qū)(通常指18-21位外顯子)若出現(xiàn)一個(gè)或一段的堿基缺失、替換等基因突變，可以刺激細(xì)胞不停地生長(zhǎng)，最終也可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生發(fā)展，甚至出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[3]。因此，本研究探討了EGFR過(guò)表達(dá)及突變對(duì)各臨床病理因素的影響和患者預(yù)后的關(guān)系，可供臨床參考。

1 材料和方法

1.1 主要的材料和設(shè)備 微量核酸分光光度計(jì)(凱奧K5500)；熒光PCR儀(ABI Prism7500)；FFPE DNA Kit(Spin Columns)和人類(lèi)EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(安徽達(dá)健醫(yī)學(xué)科技有限公司)；一抗EGFR人源(Abcam)，SABC二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；正置顯微鏡(Leica，DM3000)。

1.2 一般資料 收集成都軍區(qū)總醫(yī)院附屬口腔醫(yī)院2012年1月至2013年1月手術(shù)切除口腔鱗癌標(biāo)本42例，患者手術(shù)前均經(jīng)過(guò)病理活檢證實(shí)為口腔鱗狀細(xì)胞癌，排除手術(shù)前進(jìn)行放化療及其他治療的患者或術(shù)前存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。其中男性27例，女性15例，年齡34-83歲，平均年齡59.6歲，患者具體資料見(jiàn)表1。同時(shí)收集正常的口腔粘膜組織10例作為對(duì)照。

1.3 免疫組化染色 將收集的組織進(jìn)行石蠟包埋，制成4μm石蠟切片，按照常規(guī)免疫組化SP法進(jìn)行染色，使用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為試劑公司提供EGFR陽(yáng)性標(biāo)本。使用十三點(diǎn)評(píng)分法對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析，每例標(biāo)本在400倍顯微鏡下隨機(jī)選出10個(gè)不重疊視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照視野中陽(yáng)性細(xì)胞率進(jìn)行分級(jí)：0級(jí)=陽(yáng)性細(xì)胞率<5%；1級(jí)=陽(yáng)性細(xì)胞率5%-24%；2級(jí)=陽(yáng)性細(xì)胞率25%-49%；3級(jí)=陽(yáng)性細(xì)胞率50%-74%；4級(jí)=陽(yáng)性細(xì)胞率≥75%；按照染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)價(jià)：1級(jí)=淡黃色；2級(jí)=黃棕色；3級(jí)=棕褐色。將陽(yáng)性細(xì)胞率分級(jí)數(shù)乘以染色強(qiáng)度的分級(jí)數(shù)得到最終評(píng)分：≤1為陰性；2-4為低表達(dá)；≥5為過(guò)表達(dá)(圖1)。

圖1 A.EGFR陰性(×400)；B.EGFR低表達(dá)(×400)；C.EGFR過(guò)表達(dá)(×400)

1.4 基因突變檢測(cè) 將表1中12例局部晚期口腔鱗癌石蠟包埋組織每例切片5-10片(5μm厚)，按照石蠟包埋組織DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)上進(jìn)行操作，提取的DNA溶液于-20℃保存，使用微量分光光度計(jì)進(jìn)行DNA濃度和純度測(cè)試，DNA純度正常值OD260/OD280比值應(yīng)在1.7-1.9之間，OD260/OD230≥1.7，DNA樣本含量需大于5ng/μl。確保標(biāo)本DNA溶液濃度及純度正常后，按照EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)上步驟運(yùn)用42位點(diǎn)ARMS熒光PCR法，將稀釋后的標(biāo)本溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)分析標(biāo)本EGFR基因突變情況(圖2)。

圖2 EGFR存在突變(A)；EGFR未存在突變(B)

1.5 隨訪(fǎng) 通過(guò)查詢(xún)病例、電話(huà)等方式對(duì)所有患者進(jìn)行術(shù)后回訪(fǎng)，其中有隨訪(fǎng)結(jié)果38例，隨訪(fǎng)年限為5年，分別記錄患者是否復(fù)發(fā)、生存時(shí)間和生存結(jié)局。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單因素分析采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法和Log rank 檢驗(yàn),P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 EGFR表達(dá)與口腔鱗癌患者臨床及病理因素之間的關(guān)系 42例口腔鱗癌組織中，過(guò)表達(dá)23例，低表達(dá)14例，總表達(dá)率88.1%，10例正常黏膜組織中EGFR無(wú)表達(dá)或僅有少量表達(dá)，兩者之間有明顯差異(P<0.05)。EGFR表達(dá)與性別、分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)顯著差異(P>0.05)，僅與年齡存在相關(guān)性(P=0.027)，且年齡<60歲的患者陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于≥60歲的患者(表1)。

表1 EGFR表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 EGFR表達(dá)與口腔鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系 EGFR表達(dá)與腫瘤無(wú)復(fù)發(fā)生存率和總體生存率的關(guān)系(P>0.05)，EGFR表達(dá)強(qiáng)弱與患者預(yù)后無(wú)顯著相關(guān)性(圖3)。

圖3 EGFR表達(dá)與無(wú)腫瘤復(fù)發(fā)生存率

2.3 EGFR基因突變與局部轉(zhuǎn)移的口腔鱗癌患者的關(guān)系 在12例出現(xiàn)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的口腔鱗癌患者組織中，EGFR酪氨酸激酶區(qū)域(18-21號(hào)外顯子)均未發(fā)生基因突變。

3 討 論

本研究選取42例不同分化程度的口腔鱗癌組織和10例正?？谇火つそM織，EGFR在口腔鱗癌組織中表達(dá)率達(dá)88.1%，而在正?？谇火つそM織未出現(xiàn)表達(dá)或僅少量表達(dá)(陽(yáng)性細(xì)胞率<5%)，這與國(guó)內(nèi)外大多數(shù)研究結(jié)果相一致[4]。在EGFR表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系上，EGFR表達(dá)并未與性別、分化程度、臨床分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而僅在年齡上存在顯著差異，研究結(jié)果跟馬捷等[5]相一致，然而，吳潤(rùn)葉等[6]研究結(jié)果并未在年齡上存在差異，究其結(jié)果可能與(1)檢測(cè)EGFR表達(dá)的方法(2)免疫組化評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)(3)樣本量等因素相關(guān)。EGFR表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系并未出現(xiàn)顯著相關(guān)，但從其生存函數(shù)曲線(xiàn)圖中可以看出EGFR表達(dá)強(qiáng)度越高，出現(xiàn)復(fù)發(fā)和死亡幾率越大，此外，國(guó)外的許多針對(duì)EGFR表達(dá)與預(yù)后關(guān)系的大樣本研究并沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的結(jié)果[7]。關(guān)于EGFR突變的研究多見(jiàn)于非小細(xì)胞肺癌，而EGFR基因突變也是影響表皮生長(zhǎng)因子酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)分子靶向藥物治療效果的關(guān)鍵，Lai等[8]研究報(bào)道了肺鱗癌的EGFR基因突變率為14.5%，但國(guó)內(nèi)外關(guān)于口腔鱗癌的EGFR酪氨酸激酶區(qū)域(18-21號(hào)外顯子)基因突變的研究并不多見(jiàn)，通過(guò)對(duì)口腔鱗癌組織EGFR突變的研究有助于了解口腔鱗癌發(fā)生的分子機(jī)制，并對(duì)開(kāi)發(fā)新型EGFR-TKI分子靶向藥物臨床用于治療口腔鱗癌有指導(dǎo)意義。但是，本實(shí)驗(yàn)研究的12例局部轉(zhuǎn)移的口腔鱗癌組織中，并未出現(xiàn)18-21外顯子的突變,這與Temam等[9]的研究結(jié)果一致，但也可能跟樣本量太少有關(guān)，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明EGFR蛋白的表達(dá)和基因突變之間沒(méi)有關(guān)聯(lián)。

綜上所述，口腔鱗癌發(fā)生及發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，EGFR是一個(gè)極具研究?jī)r(jià)值的分子靶點(diǎn)，對(duì)EGFR蛋白進(jìn)行檢測(cè)不但可以從分子水平了解腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程，而且還可以有效指導(dǎo)分子靶向藥物的使用。臨床上常用的分子靶向藥物分為單克隆抗體、酪氨酸酶抑制劑、新生血管抑制劑、轉(zhuǎn)錄因子為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物、以DNA拓?fù)涿笧榘悬c(diǎn)的抗腫瘤藥物等。目前國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)應(yīng)用于口腔鱗癌的分子靶向藥物僅有西妥昔單抗(Cetuximab)一種[10]，且Cetuximab作為單克隆抗體臨床用于治療頭頸部鱗癌，其適應(yīng)癥為局部晚期頭頸部鱗癌或出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的頭頸部鱗癌，許多研究均表明EGFR表達(dá)情況對(duì)Cetuximab的療效及患者的預(yù)后有較大影響。隨著臨床研究的不斷進(jìn)行和對(duì)EGFR分子機(jī)制的深入研究，關(guān)于EGFR蛋白的檢測(cè)方法和評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)會(huì)更加統(tǒng)一，相信未來(lái)會(huì)有更多以EGFR為靶點(diǎn)的分子靶向藥物應(yīng)用于臨床，從而使口腔鱗癌患者從中受益。

【參考文獻(xiàn)】

[1]POMERANTZRG,GRANDISJR.Theroleofepidermalgrowthfactorreceptorinheadandnecksquamouscellcarcinoma[J].CurrOncolRep, 2003, 5(2): 140-146.

[2]PGONCZY,CECHEVERRI,KOEGEMA，etal.Functionalgenomicanalysisidentifiedepidermalgrowthfactorreceptoractivationasthemostcommongeneticeventinoralsquamouscellcarcinoma[J].CancerRes, 2009, 69(6) : 2568- 2576.

[3] 武曉楠.表皮生長(zhǎng)因子受體基因在多種腫瘤中的突變情況及臨床意義[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2008，11(7A)：1197-1201.

[4]SACCOASSUNTINAG,WORDENFRANCISP.Molecularlytargetedtherapyforthetreatmentofheadandneckcancer:areviewoftheErbBfamilyinhibitors[J].OncoTargetsTher, 2016, 9：1927-1943.

[5] 馬捷，劉瑩，朱東旺，等.EGFR在局部晚期口腔鱗癌中的表達(dá)及與TPF誘導(dǎo)化療的關(guān)系[J].中國(guó)口腔頜面外科雜志，2013，11(3)：209-214.

[6] 吳潤(rùn)葉，高黎，楊偉志，等.頭頸部癌表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)及對(duì)預(yù)后判斷價(jià)值[J].腫瘤學(xué)雜志，2007，13(5)：384-387.

[7]JWOO,ELAU,RKAY,etal.Prognosticvalueofepidermalgrowthfactorreceptorexpressioninpatientswithadvancedstagenasopharyngealcarcinomatreatedwithinductionchemotherapyandradiotherapy[J].IntJRadiatOncolBiolPhys, 2004, 59(1)11-20.

[8]YLAI,ZZHANG,JLI,etal.EGFRmutationsinsurgicallyresectedfreshspecimensfrom697consecutiveChinesepatientswithnon-smallcelllungcancerandtheirrelationshipswithclinicalfeatures[J].IntJMolSci, 2013, 14(12): 24549.

[9]TEMAMSTEPHANE,KAWAGUCHI,HIDETOSHI,etal.Epidermalgrowthfactorreceptorcopynumberalterationscorrelatewithpoorclinicaloutcomeinpatientswithheadandnecksquamouscancer[J].JClinOncol, 2007, 25(16): 2164-2170.

[10]DAIW,LIY,ZHOUQ,etal.Cetuximabinhibitsoralsquamouscellcarcinomainvasionandmetastasisviadegradationofepidermalgrowthfactorreceptor[J].JournalofOralPathology&Medicine, 2014, 43(4):250-257.