4-氨基安替比林法快速檢測(cè)異丙酚的含量

安 琪，李 莉，王婷婷，刁娟娟

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011)

異丙酚又名丙泊酚，為烷基酚類(lèi)短效麻醉藥。異丙酚是臨床首選的靜脈麻醉和鎮(zhèn)靜藥，在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于手術(shù)麻醉的誘導(dǎo)和維持，在體內(nèi)代謝速度快[1]，個(gè)體差異較大，需要對(duì)其進(jìn)行血藥濃度檢測(cè)，建立快速檢測(cè)異丙酚的方法。目前，異丙酚的測(cè)定方法有高效液相色譜-熒光或紫外檢測(cè)法[2-4]、GC法[5]、質(zhì)譜法[6-8]、離子遷移譜法[9-10]、HPLC-MS法[11-12]、GC-MS法[13-14]和光纖傳感法[15]等，這些方法儀器昂貴、操作復(fù)雜，且不便于進(jìn)行異丙酚的快速檢測(cè)。本文選擇酚類(lèi)物質(zhì)快速檢測(cè)的4-氨基安替比林法[16]對(duì)異丙酚進(jìn)行衍生化后測(cè)定，能使異丙酚的檢測(cè)波長(zhǎng)紅移，避免樣品基質(zhì)的干擾，建立檢測(cè)異丙酚注射液中異丙酚含量的測(cè)定方法，該方法與《中國(guó)藥典》2015年版中異丙酚含量測(cè)定的HPLC法[17]相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4-氨基安替比林法可用于異丙酚含量的快速檢測(cè)，為其血藥濃度的監(jiān)測(cè)奠定研究基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，高效液相色譜儀(LC-20AT四元泵，SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，LC solution 操作系統(tǒng))，均購(gòu)自日本島津公司；pHSJ-3F雷磁pH計(jì)(上海圖新電子科技有限公司)；AB135-S電子分析天平(天津賽多利斯天平有限公司)。

1.2試藥 異丙酚對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100806-201402)；得普利麻異丙酚注射液(20 mL∶200 mg，阿斯利康制藥有限公司，批號(hào)1205045)；樂(lè)維靜異丙酚注射液(20 mL∶200 mg，四川國(guó)瑞藥業(yè)有限公司，批號(hào)1211094)；丙三醇、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、過(guò)氧化氫和4-氨基安替比林均為分析純；辣根過(guò)氧化物酶(150U)、蛋黃卵磷脂為生化制劑；大豆油為藥用輔料；實(shí)驗(yàn)用水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱(chēng)取異丙酚對(duì)照品71.40 mg(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%)，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至100 mL，得質(zhì)量濃度為712.57 μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2供試品溶液 精密量取1.0 mL異丙酚注射液，加體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液溶解并稀釋至10 mL；再精密量取200 μL，加體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液溶解并稀釋至10 mL，搖勻，即得。

2.1.3磷酸鹽緩沖液(pH值為7.4) 取磷酸二氫鉀1.36 g，加0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液79 mL，再加水稀釋至200 mL，即得。

實(shí)驗(yàn)用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)溶液、過(guò)氧化氫溶液和4-氨基安替比林溶液均用磷酸鹽緩沖液配制，且使用時(shí)當(dāng)天配制。

2.2測(cè)定方法 依次精密量取0.5 mL過(guò)氧化氫(25 mmol·L-1)、0.5 mL異丙酚供試品、0.5 mL辣根過(guò)氧化物酶(0.5 mg·mL-1)和0.5 mL 4-氨基安替比林(20 mmol·L-1)，置于同一10 mL具塞試管中，振搖2 min，40 ℃水浴加熱5 min。以體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇為參比，于490 nm波長(zhǎng)處用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值。

2.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 4-氨基安替比林在過(guò)氧化氫和辣根過(guò)氧化物酶的催化下，與異丙酚酚羥基對(duì)位的活潑氫發(fā)生偶合反應(yīng)，在一定溫度下可生成橘紅色化合物，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物在200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜掃描，于490 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因此，選取490 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察 精密量取2.1.1項(xiàng)下制備的異丙酚對(duì)照品儲(chǔ)備液52.60 mL，用體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇稀釋至100 mL，得質(zhì)量濃度為374.81 μg·mL-1的溶液；再精密量取質(zhì)量濃度為374.81 μg·mL-1的異丙酚溶液0.125，0.25，0.5，1.0，1.5和2.0 mL，用體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇稀釋至100 mL，制備得到質(zhì)量濃度分別為4.69，9.37，18.74，37.48，56.22和74.96 μg·mL-1的異丙酚溶液。按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，以異丙酚對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、吸光度值為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.011x+0.024 9，相關(guān)系數(shù)r=0.998 6。結(jié)果表明，質(zhì)量濃度在4.69～74.96 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2精密度實(shí)驗(yàn) 取得普利麻異丙酚注射液(批號(hào)1205045)，按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)測(cè)定6次，以質(zhì)量濃度計(jì)算RSD值為0.14%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.4.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取得普利麻異丙酚注射液(批號(hào)1205045)樣品6份，按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，RSD值為2.67%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.4.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取得普利麻異丙酚注射液(批號(hào)1205045)，按照2.1.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液3份，按照2.2項(xiàng)下測(cè)定方法分別于0，15，30，45，60，90和120 min測(cè)定吸光度值，RSD值為2.13%，結(jié)果表明，樣品在90 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的樣品(批號(hào)1205045)置于10 mL量瓶中，分別加入相當(dāng)于樣品中已知含量80%,100%和120%的異丙酚對(duì)照品，按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，異丙酚平均加樣回收率為104.05%，RSD值為3.01%。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5樣品測(cè)定 取得普利麻異丙酚注射液(批號(hào)1205045)和樂(lè)維靜異丙酚注射液(批號(hào)1211094)，按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，各批號(hào)樣品平行測(cè)定3次。4-氨基安替比林法測(cè)得的得普利麻異丙酚注射液中異丙酚的平均含量為10.28 mg·mL-1，RSD值為0.50%；樂(lè)維靜異丙酚注射液中異丙酚的平均含量為9.81 mg·mL-1，RSD值為0.31%。

2.6HPLC法測(cè)定異丙酚含量 采用《中國(guó)藥典》2015年版中丙泊酚測(cè)定項(xiàng)下的HPLC法進(jìn)行驗(yàn)證。

2.6.1色譜條件 色譜柱：VP-ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：0.02 mol·L-1磷酸二氫鈉緩沖液(pH值為3.0)為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B(日本島津公司)，梯度洗脫，洗脫程序：0～22 min，40%B；22～38 min，40%～70%B；38～40 min，70%B；40～41 min，70%～90%B；41～45 min，90%B；45～46 min，90%～40%B。流速：1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm;柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.6.2測(cè)定方法 取得普利麻異丙酚注射液(批號(hào)1205045)和樂(lè)維靜異丙酚注射液(批號(hào)1211094)，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1的溶液，搖勻，作為供試品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。另取異丙酚對(duì)照品，同法進(jìn)行測(cè)定。按照外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得，見(jiàn)表2。由表2可知，HPLC法測(cè)得的得普利麻異丙酚注射液中異丙酚的平均含量為10.24 mg·mL-1，RSD值為3.62%；樂(lè)維靜異丙酚注射液中異丙酚的平均含量為9.91 mg·mL-1，RSD值為3.09%。結(jié)果表明，經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)(檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05)，4-氨基安替比林法與HPLC法測(cè)定異丙酚注射液中異丙酚的含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表22種測(cè)定方法結(jié)果的比較

Tab.2 Comparison of the result of the 2 methods

樣品名稱(chēng)4?氨基安替比林法質(zhì)量濃度/μg·mL-1含量/mg·mL-1平均含量/mg·mL-1RSD/%HPLC法質(zhì)量濃度/μg·mL-1含量/mg·mL-1平均含量/mg·mL-1RSD/%得普利麻126．7810．3010．280．5055．1510．6110．243．62得普利麻226．5910．2353．2310．24得普利麻326．8510．3351．299．86樂(lè)維靜125．589．849．810．3149．749．579．913．09樂(lè)維靜225．439．7852．8110．16樂(lè)維靜325．539．8251．9910．00

圖1HPLC圖

A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照品；1.異丙酚。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substances；B.sample；C.negative reference substance；1.propofol.

3 討論

3.14-氨基安替比林法空白值的影響 4-氨基安替比林為黃色固體，易吸潮分解、結(jié)塊、氧化變質(zhì)，會(huì)使空白值明顯偏高；若4-氨基安替比林略帶紅色，則需加入氯仿萃取提純后使用[18-19]。試劑要按照順序依次加入過(guò)氧化氫、異丙酚、辣根過(guò)氧化物酶和4-氨基安替比林；若先加入4-氨基安替比林溶液會(huì)生成安替比林紅使空白值偏高，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.2注射液輔料的影響 異丙酚注射液的輔料中含有大豆油、甘油和卵磷脂[20]，通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜掃描，發(fā)現(xiàn)這些輔料對(duì)異丙酚測(cè)定無(wú)干擾，4-氨基安替比林法適合異丙酚注射液的快速檢測(cè)。

3.34-氨基安替比林法與HPLC法測(cè)定異丙酚含量的比較 本實(shí)驗(yàn)建立了4-氨基安替比林法測(cè)定異丙酚的含量，并將該法與《中國(guó)藥典》收載的HPLC法進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HPLC法測(cè)定1個(gè)樣品需50 min，而4-氨基安替比林法測(cè)定樣品僅需6～8 min。綜上所述，4-氨基安替比林法靈敏度高、簡(jiǎn)單易行、耗時(shí)短，為快速準(zhǔn)確地測(cè)定異丙酚提供了新方法，為異丙酚的藥物監(jiān)測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Colucci A P，Gagliano-Candela R，Aventaggiato L，et al.Suicide by self-administration of a drug mixture (propofol，midazolam，and zolpidem)in an anesthesiologist:the first case report in Italy[J].J Forensic Sci，2013，58(3):837-841.

[2] 李莉，李培.反相高效液相梯度洗脫法測(cè)定人血漿中丙泊酚濃度[J].安徽醫(yī)藥，2015，19(4)：669-672.

[3] 馬愛(ài)玲，張海峰，董玲芳，等.高效液相色譜法測(cè)定丙泊酚注射液中丙泊酚的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，33(4)：496-497.

[4] 宋宇紅，唐麗琴，胡世林，等.HPLC法測(cè)定人血漿中丙泊酚濃度[J].中國(guó)藥師，2013，16(7)：993-995.

[5] Laurila T，Sorvaj?rvi T，Saarela J，et al.Optical detection of the anesthetic agent propofol in the gas phase[J].Anal Chem，2011，83(10):3963-3967.

[6] Hornuss C，Dolch M E，Janitza S，et al.Determination of breath isoprene allows the identification of the expiratory fraction of the propofol breath signal during real-time propofol breath monitoring[J].J Clin Monit Comput，2013，27(5):509-516.

[7] Elizarov A Y.A membrane separator interface for mass-spectrometric analysis of desflurane，propofol，and fentanyl in blood plasma and cerebrospinal fluid[J].Instrum Exp Tech，2016，59(3):458-461.

[8] Cherebillo V Y，Sokolov V N，Elokhin V A，et al.Membrane separator interface for mass-spectrometric analysis of desflurane，propofol and fentanyl in plasma and cerebrospinal fluid[J].Int J Med Phys Clin Eng Radiat Oncol，2015，(4):263-267.

[9] Zhou Q，Hua L，Wang C，et al.Improved analytical performance of negative63Ni ion mobility spectrometry for on-line measurement of propofol using dichloromethane as dopant[J].J Am Soc Mass Spectrom，2015，26(1):190-193.

[10]Buchinger H，Kreuer S，Hellbrück R，et al.Minimal retarded propofol signals in human breath using ion mobility spectrometry[J].Int J Ion Mobil Spec，2013，(16):185-190.

[11]Chen X，Zhang X L，Liu L，et al.Gas chromatograph-surface acoustic wave for quick real-time assessment of blood/exhaled gas ratio of propofol in humans[J].Br J Anaesth，2014，113(5):807-814.

[12]El Hamd M A，Wada M，Ikeda R，et al.Validation of an LC-MS/MS method for the determination of propofol，midazolam，and carbamazepine in rat plasma：application to monitor their concentrations following co-administration.[J].Biol Pharm Bull，2015，38(8):1250-1253.

[13]Vaiano F，Mari F，Busardò F P，et al.Enhancing the sensitivity of the LC-MS/MS detection of propofol in urine and blood by azo-coupling derivatization[J].Anal Bioanal Chem，2014，406(15):3579-3587.

[14]Pyo J S.Selective and accurate determination method of propofol in human plasma by mixed-mode cation exchange cartridge and GC-MS[J].J Anal Methods Chem，2016，2016:1-5.

[15]李莉，王慶振.毛細(xì)管微萃取結(jié)合光纖傳感在線檢測(cè)全血中異丙酚含量[J].西北藥學(xué)雜志，2016，31(1)：37-40.

[17]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典：2015年版：二部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：136-137.

[18]丁勝.揮發(fā)酚測(cè)定中4-氨基安替比林的應(yīng)用[J].污染防治技術(shù)，2013，26(3)：58-60.

[19]梁濤，韓靜，許芳，等.4-氨基安替比林法快速測(cè)定飲用水中酚[J].環(huán)境衛(wèi)生學(xué)雜志，2014，4(5)：491-493.

[20]邢晉華.丙泊酚注射液的制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2011.