參威骨痹顆粒的提取工藝研究

陳 坤，余曉玲，陳凌云*

(1.云南中醫(yī)學院，昆明 650500；2.云南中醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，昆明 650051)

參威骨痹方是云南省榮譽名中醫(yī)冮順奎主任醫(yī)師潛心研究的治療骨關節(jié)炎的經驗方，由威靈仙、小紅參、白芍和獨活等10余味藥組成，其中小紅參和威靈仙為君藥，白芍等為臣藥，具有養(yǎng)血活血、通絡除痹之功效。該方原為湯劑，為使患者服用方便、便于攜帶，現(xiàn)擬將其開發(fā)成醫(yī)療機構制劑。根據處方中各藥味中有效成分的理化性質，先把當歸、川芎、獨活和桂枝4味藥混合提取揮發(fā)油[1-5]，揮發(fā)油備用；再把4味藥的藥渣與余下藥味通過 L9(34)正交實驗，以干膏得率和HPLC色譜法測定的芍藥苷[6-13]轉移率綜合評分為評價指標，優(yōu)化參威骨痹顆粒的提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1儀器 DFY-500搖擺式高速中藥粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；CP124C-電子天平(上海精密儀器儀表有限公司)；101-2AB-電熱鼓風干燥器(天津市泰斯特儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器廠)；UltiMate3000高效液相色譜儀(包括四元梯度泵，自動進樣器，二極管陣列檢測器，柱溫箱)(美國戴安公司)；色譜柱C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，S/N:0J7U73，Kromat Universil)(科瑞邁公司)；分析天平(型號：AL104METTLER TOLEDO，0.000 1 g)，分析天平(型號：AL104METTLER TOLEDO, 0.000 1 g)(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；揮發(fā)油提取器(北京天連和諧儀器儀表有限公司)。

1.2試藥 小紅參、威靈仙和白芍等藥材均由云南中醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院提供；芍藥苷(中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號110736-200934，質量分數(shù)≥98.0%)；乙腈(色譜純，德國Merck公司，批號1685730321)；磷酸(分析純，天津市化學試劑三廠，批號110108)；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1揮發(fā)油提取工藝研究 根據生產實際條件，選擇共水蒸餾法，以揮發(fā)油量為指標，單因素實驗考察浸泡時間、加水量和提取時間對揮發(fā)油提取的影響。

2.1.1浸泡時間的考察 按照處方比例,稱取獨活、當歸、川芎和桂枝藥材6份，每份330 g，各加10倍量水，分別浸泡1，2，3，4，5和6 h后，提取6 h，觀察揮發(fā)油含量，實驗結果表明，浸泡2 h后提取，揮發(fā)油含量為0.85 mL，隨著浸泡時間的增加，揮發(fā)油含量幾乎沒有增加，考慮生產實際條件，故將揮發(fā)油提取浸泡時間確認為2 h。

2.1.2提取時間的考察 按照處方比例，稱取獨活、當歸、川芎和桂枝藥材共330 g,加10倍量水,浸泡2 h，每1 h觀察揮發(fā)油含量1次，直至揮發(fā)油含量不再增加為止，實驗結果表明，提取6 h后，揮發(fā)油含量為0.85 mL，且隨著提取時間的延長，揮發(fā)油含量幾乎沒有增加，且顏色加深，影響揮發(fā)油質量，故將揮發(fā)油提取時間確認為6 h。

2.1.3加水量的考察 按照處方比例，稱取獨活、當歸、川芎和桂枝4味藥材各5份,每份330 g,分別加6，8，10、12和14倍量水，浸泡2 h，提取6 h，讀取揮發(fā)油體積，結果表明，加水量為10倍量以上時，揮發(fā)油含量為0.85 mL，沒有增加，故確認加水量為10倍量。

2.1.4揮發(fā)油提取工藝驗證實驗 揮發(fā)油提取單因素實驗結果表明，本方揮發(fā)油提取的最佳工藝為浸泡2 h，加10倍量水，提取6 h。按照處方比例稱取藥材照共3份，每份330 g，按照上述條件做工藝驗證實驗，結果顯示，3份揮發(fā)油的平均含量為0.83 mL，揮發(fā)油提取率為0.258%，結果表明，該提取工藝穩(wěn)定可行。

2.2水提工藝正交優(yōu)化研究

2.2.1因素水平的確定 在預實驗基礎上，選擇加水倍量、提取時間和提取次數(shù)3個因素[14-17]，以干膏得率和芍藥苷轉移率綜合評分為指標進行考察，對實驗結果進行方差分析，考察各因素對實驗的影響程度大小，最終確定各參數(shù)的水平。據此選擇最佳提取工藝條件。因素水平見表1。

表1實驗因素與水平

Tab.1 Experimental factors and levels

因素水平A，加水倍量/倍B，提取時間/hC，提取次數(shù)18112101．5231223

2.2.2評價指標

2.2.2.1干膏得率的測定 按照處方比例稱取各味飲片，共215 g，按照規(guī)定條件加水煎煮，取濾液適當濃縮，定容至250 mL，精密吸取10 mL，置于已干燥至恒質量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，將殘渣置于105 ℃烘箱中干燥3 h，取出，置于干燥器中冷卻30 min，迅速稱定其質量，計算干膏得率，見表3。

2.2.2.2芍藥苷含量的測定及轉移率的計算 ①色譜條件：色譜柱：C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm；以乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(14∶86)為流動相；檢測波長為230 nm，流速：1 mL·min-1，柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。理論板數(shù)按照芍藥苷峰計算不低于2 000[18-19]。

②溶液的制備：對照品溶液：精密稱取芍藥苷對照品，加甲醇溶解并稀釋成質量濃度為132 μg·mL-1的對照品溶液。

藥材供試品溶液：取白芍藥材粉末0.1 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加稀乙醇(取乙醇529 mL,加水稀釋至1 000 mL，即得)35 mL，超聲處理30 min，加稀乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

復方供試品溶液：按照處方比例稱取各味飲片，按照表3規(guī)定條件加水煎煮，取濾液適當濃縮，定容至250 mL，精密吸取10 mL，置于干燥蒸發(fā)皿中，水浴揮干，殘渣加稀乙醇35 mL使溶解，超聲30 min，加稀乙醇定容至50 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照溶液：按照處方比例制成缺白芍的陰性樣品，按照上述復方供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

③專屬性考察：分別精密吸取上述制備的對照品溶液、藥材供試品溶液、復方供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。

由圖1可知，陰性對照色譜圖中，在與對照品溶液、藥材供試品溶液和復方供試品溶液色譜圖的芍藥苷峰相應位置處無相同吸收峰，結果表明專屬性良好。

圖1HPLC圖

A.對照品溶液；B.藥材供試品溶液；C.復方供試品溶液；D.陰性對照溶液；1.芍藥苷。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference solution；B.herbs sample solution；C.compound sample solution;D.negative solution；1.paeoniflorin.

④線性范圍考察：精密稱取芍藥苷對照品0.262 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，得質量濃度為262 μg·mL-1的芍藥苷對照品溶液。分別精密吸取該對照品溶液1，2，5，10，15，20和25 μL，注入高效液相色譜儀，按照上述色譜條件測定峰面積，以峰面積值為縱坐標(y)、芍藥苷進樣量為橫坐標(x)進行線性回歸，得y=10.666x+0.381 5 (r=0.999 9)，結果表明，芍藥苷進樣量在0.262～6.550 μg之間，峰面積與進樣量線性關系良好。

⑤精密度實驗：精密吸取對照品溶液10 μL，按照上述色譜條件重復進樣6次，計算芍藥苷峰面積的RSD值為0.13%，結果表明，該儀器精密度良好。

⑥重復性實驗：按照處方比例，稱取1倍處方量，煎煮，濃縮，定容，精密移取10 mL，共6份，按照復方供試品溶液制備方法進行處理，進行含量測定，以外標法計算芍藥苷含量的RSD值為1.08%(n=6)。結果表明，該方法重復性良好。

⑦對照品溶液穩(wěn)定性實驗：精密吸取同一對照品溶液，分別于1，2，4，8，12和24 h進樣10 μL，測定峰面積，計算峰面積的RSD值為0.06%。結果表明，對照品溶液室溫放置24 h內穩(wěn)定。

⑧供試品溶液穩(wěn)定性實驗：精密吸取同一供試品溶液，分別于1，2，4，8，12和24 h進樣10 μL，測定峰面積，計算峰面積的RSD值為1.26%。結果表明，供試品溶液室溫放置24 h內穩(wěn)定。

⑨準確性實驗：精密吸取已知含量的同一供試品溶液1 mL，共9份，分別加入適量芍藥苷對照品，精密稱定，按照復方供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件進樣分析，計算得平均回收率為100.14%，RSD值為1.1%。結果表明，該方法回收率良好。見表2。

表2芍藥苷加樣回收率結果

Tab.2 Results of recovery test for paeoniflorin

序號樣品含量/mg·mL-1對照品加入量/mg理論值/mg實測值/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%12．5501．2843．8343．82599．765100．141．122．5501．2763．8263．842100．41832．5501．2733．8233．840100．44542．5502．5875．1375．259102．37552．5502．6025．1525．06098．21462．5502．5645．1145．134100．39172．5503．7856．3356．30799．55882．5503．8076．3576．33899．70192．5503．7916．3416．366100．394

⑩藥材含量測定：取白芍藥材粉末0.1 g，共3份，精密稱定，分別置于50 mL量瓶中，加稀乙醇35 mL，超聲處理30 min，放冷，加稀乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。進樣測定，記錄色譜圖，測定峰面積，計算含量。結果表明，3份藥材中，芍藥苷含量分別為4.88%，4.60%和4.60%，芍藥苷平均含量為4.69%，符合《中國藥典》2015年版相關規(guī)定。

芍藥苷轉移率計算：已知白芍藥材中芍藥苷含量為4.69%，則芍藥苷的轉移率=液相測得的芍藥苷含量÷4.69%×方中白芍藥材用量×100%

2.2.2.3綜合評分 選擇芍藥苷轉移率及浸膏得率的綜合評分為指標，權重系數(shù)分別為70%和30%。

綜合評分=芍藥苷轉移率÷芍藥苷轉移率的最大值×70%+浸膏得率÷浸膏得率的最大值×30%

2.2.3正交實驗安排與結果 正交實驗安排與結果見表3，方差分析見表4。由表3和表4可知，各因素影響水提工藝的順序為 C>B>A，因素B和C對提取工藝有顯著影響，因素A對提取工藝無顯著性影響，應選擇提取工藝為A1B3C3，但考慮到實際生產，綜合考慮，選擇A1B3C2，即加8倍量水，煎煮2次，每次2 h。

表3正交實驗結果

Tab.3 The results of orthogonal experiment

實驗號因素ABCD干浸膏率/%芍藥苷轉移率/%綜合評分1111125．8251．2059．682122233．2971．2282．243133339．4590．63100．004212335．1473．3384．815223137．6857．6073．906231230．5061．4071．887313237．4270．4785．258321330．5561．8172．239332134．7881．8691．11綜合評分K180．64076．58067．93074．897K276．86376．12386．05379．790K382．86387．66386．38385．680R6．00011．54018．45310．783

表4芍藥苷轉移率方差分析結果

Tab.4 The variance results of paeoniflorin transfer rate

因素偏差平方和自由度FF臨界值顯著性A100．68720．47719．000P>0．05B378．10621．79019．000P<0．05C211．29022．48519．000P<0．05誤差211．2902

注：F(2,2)0.05=19.00。

2.2.4驗證實驗 為保證優(yōu)選所得水提工藝合理可行，對該工藝進行了3次驗證。取1倍處方量藥材3份，分別加8倍量水浸泡1 h后，按照A1B3C2提取，經計算得干膏得率分別為37.27%，37.09%和36.84%，芍藥苷轉移率分別為80.56%，81.77%和80.72%，二者的RSD值分別為0.58%和1.21%(n=3)，結果顯示，該工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

該處方是云南省榮譽名中醫(yī)冮順奎主任醫(yī)師潛心研究的治療骨關節(jié)炎的經驗方，具有良好的臨床效果。本實驗研究為攜帶更方便、患者順應性更好、更適宜臨床應用的醫(yī)院內中藥制劑，口服制劑一般包括合劑、口服液、膏滋劑、顆粒劑、膠囊劑和片劑等，根據本院制劑室實際情況，研究選用膏滋劑、顆粒劑和片劑3種劑型，通過預實驗，選擇顆粒劑作為該復方的合適劑型。

在設計復方提取工藝時，考慮到因其含多味揮發(fā)性藥材，故采取先提取揮發(fā)油的工藝過程，為后期揮發(fā)油的包合工藝奠定基礎。

本方中君藥之一為小紅參，其化學成分多為蒽醌類，難溶于水，另一味君藥威靈仙，依照《中國藥典》2015年版規(guī)定對齊墩果酸進行含量測定，齊墩果酸為脂溶性成分，未納為評價指標；綜合考慮，采用臣藥白芍中芍藥苷的轉移率為評價指標，由于方中藥味較多，成分復雜，故結合干膏率兩者共同作為評價指標，綜合評分中干膏得率和芍藥苷轉移率的權重系數(shù)分別為0.3和0.7，這樣得出的分數(shù)較為合理。

本研究通過干膏率和芍藥苷的含量對各正交實驗進行考察，進行直觀分析和方差分析，結果表明，煎煮時間和煎煮次數(shù)對干膏率和芍藥苷的含量均有顯著影響。根據正交實驗結果，應選擇A1B3C3，即加8倍量的水，煎煮2 h，煎煮3次，但結合實際生產條件，在節(jié)約各項資源又確保療效的情況下，選擇A1B3C2，即藥材加8倍量的水，煎煮2 h，煎煮2次。本實驗優(yōu)選的最佳工藝驗證實驗表明，產品的干膏率和芍藥苷含量穩(wěn)定、重復性好，為參威骨痹顆粒的進一步研究提供了技術支持。

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