丹酚酸B、芍藥苷和甘草酸復配在大鼠體內(nèi)的藥動學參數(shù)研究

楊春梅，曹唯儀，侯俊玲，王文全，施 露

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102；2.北京城市學院生物醫(yī)藥學部，北京 100094；3.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091；4.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193；5.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102；6.北京中醫(yī)藥大學東方學院，廊坊 065001)

丹參、赤芍和甘草為本課題組研究復方的主要組分，其中丹參中的丹酚酸B、赤芍中的芍藥苷以及甘草中的甘草酸均有不同程度對肝損傷的保護作用[1-3]，各活性成分的藥動學研究報道也很多[4-6]。本課題組前期藥理研究顯示，以上述3種水溶性成分為主體的復配組合抗肝損傷效果明顯，但3種成分復配進行的藥動學研究尚未見報道。本實驗采用血藥質(zhì)量濃度法，以高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下(HPLC-MS/MRM)測定大鼠血漿樣品中丹酚酸B、芍藥苷和甘草酸的含量，建立血漿樣品中的成分測定方法并研究3種成分復配尾靜脈給藥后的藥動學參數(shù)特征。

1 儀器與材料

1.1儀器 液相質(zhì)譜聯(lián)用儀：島津LC20A系列液相色譜儀(日本島津公司)；API 5500 三重四級桿質(zhì)譜(美國SCIEX公司)；BT125D十萬分之一分析天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)；MX-S渦旋混合儀(大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司)；3-18K型低溫高速離心機(SIGMA公司)；MilliporeTM-D 24UV純水器(美國密理博中國有限公司)；Eppendorf移液器(艾本德中國有限公司)，編碼：R10642B(1 000 μL)，Q26158B(200 μL)，L31954C(20 μL)。

1.2試藥 對照品：丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B，批號ZS0924BB14，HPLC法測質(zhì)量分數(shù)≥98%)，芍藥苷(paeoniflorin，PF，批號RM0520FA14，HPLC法測質(zhì)量分數(shù)≥98%)，甘草酸(glycyrrhizin，GL，批號YA0424YA14，HPLC法測質(zhì)量分數(shù)≥99%)，氯霉素(chloramphenicol，CAP，批號HM0328NA14，HPLC法測質(zhì)量分數(shù)≥97%)，均購自上海源葉生物科技有限公司。

動物給藥用：丹酚酸B(批號151126)、芍藥苷(批號151019)和甘草酸(批號151024)，均購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，質(zhì)量分數(shù)>98%。

試劑：乙腈，甲醇，醋酸銨[色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；甲酸(色譜純，天津市光復精細化工研究所)；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

1.3動物 Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量200±20 g，合格證號SCXK(京)2012-0004，動物實驗設(shè)施使用許可證號：2012-0065,購于北京斯倍福實驗動物科技有限公司，動物房保持通風，干燥，室溫22～25 ℃，濕度50%～70%，自由飲水，鼠料定量飼養(yǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1液相色譜條件 色譜柱：Phenomenex Luna 3 μm C18(2) 100A，50 mm×2 mm，S/N：763307-1，流動相：A：10 mL·L-1甲酸水溶液，B：2 mL·L-1甲酸[乙腈∶甲醇(1∶3)]梯度洗脫，0～1.2 min:55%A→60%A，1.2～1.5 min:60%A→5%A，1.5～3 min:5%A，3～5 min:5%A→55%A，5～8 min:55%A。流速：0.2 mL·min-1；進樣量：5 μL；自動進樣器溫度：15 ℃；柱溫：40 ℃；保留時間：PF 1.25 min，Sal B 1.23 min，GL 6.15 min。

2.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源 (electrospray ionization source，ESI源)，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)。在負離子模式下檢測離子對Sal Bm/z717→519，GLm/z821→351，CAPm/z321→152.1；在正離子模式下檢測離子對PFm/z498→301，CAPm/z340→274.7。

2.3對照品溶液和質(zhì)量控制溶液的配制 對照溶液的配制：精密稱量Sal B對照品20 mg，加水溶解配制成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的對照品溶液；分別精密稱量PF、GL對照品，加甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的對照溶液。以上溶液作為對照溶液儲備液備用，冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｈal B、PF和GL儲備液100，70和200 μL，分別加水稀釋成Sal B質(zhì)量濃度為0.08，0.2，1，5，10，20和25 mg·L-1的系列工作溶液，PF質(zhì)量濃度為0.056，0.14，0.7，3.5，7，14和17.5 mg·L-1的系列工作溶液，GL質(zhì)量濃度為0.16，0.4，2，10，20，40和50 mg·L-1的系列工作溶液，備用。

(1)質(zhì)控溶液的配制：取各成分儲備溶液，分別配制低、中、高3個濃度的質(zhì)控溶液，Sal B的質(zhì)量濃度為0.24，12.50和18.75 mg·L-1；PF的質(zhì)量濃度為0.17，8.75和13.12 mg·L-1；GL的質(zhì)量濃度為0.48，25.00和37.50 mg·L-1。

(3)內(nèi)標溶液的配制：精密稱取CAP對照品適量(>10 mg)，用純度計算，加甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的溶液，用乙腈(含3 mL·L-1甲酸)稀釋至質(zhì)量濃度為50 μg·L-1的溶液，備用。

2.4動物實驗設(shè)計 健康Wistar大鼠8只，實驗前12 h禁食不禁水，實驗期間自由飲水。尾靜脈注射Sal B(1 mg·kg-1)、PF(5 mg·kg-1)和GL(1.5 mg·kg-1)的復配混合液，給藥體積為3 mL·kg-1體質(zhì)量。給藥后分別于0.08，0.25，0.5，0.75，1，2，4，6，8，10和12 h從眼底靜脈叢取血0.3 mL，置于肝素鈉抗凝處理過的試管中，以3 500 r·min-1離心15 min，分離轉(zhuǎn)移血漿，置于-20 ℃冰箱中保存。

2.5血漿樣品前處理 正常處理：精密吸取40 μL血漿樣品(標準曲線和質(zhì)控樣品為30 μL血漿+10 μL工作液)，加入5 μL 30 mL·L-1甲酸，混勻，加入150 μL乙腈(含內(nèi)標，3 mL·L-1甲酸)，渦旋振蕩2 min，以12 000 r·min-1離心5 min，取上清液150 μL，氮氣50 ℃吹干，用50 μL水復溶，渦旋振蕩1 min，以12 000 r·min-1離心5 min，取上清液進樣。

基質(zhì)提取后加入處理：精密吸取30 μL血漿樣品，加入5 μL 30 mL·L-1甲酸，混勻，加入150 μL乙腈(含內(nèi)標，3 mL·L-1甲酸)，渦旋振蕩2 min，以12 000 r·min-1離心5 min，取上清液150 μL，氮氣50 ℃吹干，加入10 μL工作液以及40 μL水溶液，渦旋振蕩1 min，以12 000 r·min-1離心5 min，取上清液進樣。

不含基質(zhì)處理：精密吸取30 μL水溶液，加入10 μL工作液，加入5 μL 30 mL·L-1甲酸，混勻，加入150 μL乙腈(含內(nèi)標，3 mL·L-1甲酸)，渦旋振蕩2 min，取上清液150 μL，氮氣50 ℃吹干，50 μL水復溶，進樣。

2.6數(shù)據(jù)的采集和處理 采用2.1和2.2項下方法測定樣品中的Sal B，PF和GL；采用內(nèi)標法，將目標成分峰面積AS和內(nèi)標CAP峰面積Ai的比值帶入標準曲線計算樣品中的各成分含量，采用Analyst 1.6.2對數(shù)據(jù)進行采集和處理。

各給藥組血藥質(zhì)量濃度-時間數(shù)據(jù)采用WinNonlin 7.0藥動學軟件按照非房室模型進行處理，計算藥動學參數(shù)；采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，藥動學參數(shù)的對比分析采用t檢驗。

2.7方法學考察

2.7.1專屬性實驗 大鼠空白血漿、空白血漿加混合對照品的HPLC圖見圖1至圖2。負離子模式下Sal B，GL和CAP保留時間分別是1.23，6.15和1.61 min；正離子模式下PF和CAP的保留時間分別是1.25和1.60 min?？瞻籽獫{的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾各成分和內(nèi)標的測定，該方法專屬性良好。

圖1負離子模式下大鼠血漿中丹酚酸B、甘草酸及內(nèi)標的HPLC圖

A.空白血漿； B.空白血漿加丹酚酸B對照品； C.空白血漿加甘草酸對照品； D.空白血漿加氯霉素對照品； 1.丹酚酸B； 2.甘草酸； 3.氯霉素。

Fig.1 Negative ion mode chromatograms of Sal B，GL and internal standard (IS) in rat plasma

A.blank plasma； B.blank plasma mixed with Sal B； C.blank plasma mixed with GL； D.blank plasma mixed with CAP； 1.Sal B； 2.GL； 3.CAP.

2.7.2線性范圍和定量下限 按照2.5項下方法制備血漿樣品并進行樣品處理，按照2.1和2.2項下液質(zhì)條件檢測，以待測成分峰面積與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標(y)、對樣品質(zhì)量濃度(x)進行線性回歸，得到標準曲線方程。Sal B質(zhì)量濃度在0.02～6.25 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標準曲線y=0.000 703x-0.005 75(r=0.998 2)；PF質(zhì)量濃度在0.01～4.38 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標準曲線回歸方程為y=0.003 75x+0.006 7(r=0.997 1)；GL質(zhì)量濃度在0.04～12.50 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標準曲線回歸方程為y=0.000 733x-0.023 9(r=0.991 2)。

圖2正離子模式下大鼠血漿中芍藥苷和內(nèi)標的HPLC圖

A.空白血漿；B.空白血漿加芍藥苷對照品；C.空白血漿加氯霉素對照品；1.芍藥苷；2.氯霉素。

Fig.2 Positive ion mode chromatograms of PF and internal standard (IS) in rat plasma

A.blank plasma； B.blank plasma mixed with PF； C.blank plasma mixed with CAP； 1.PF； 2.CAP.

2.7.3精密度和準確度實驗 取2.3項下制備的質(zhì)量控制溶液，各6份，按照2.5項下方法處理，得到各質(zhì)量濃度質(zhì)量控制樣品，按照2.1和2.2液質(zhì)條件連續(xù)測定3 d，分別考察日內(nèi)和日間精密度和準確度，結(jié)果見表1。由表1可知，Sal B日內(nèi)和日間3個測量質(zhì)量濃度的平均回收率在99.2%～105.7%之間(RSD值為4.76%～7.39%)；PF平均回收率在96.5%～100.5%之間(RSD值為1.93%～8.31%)；GL平均回收率在96.5%～103.4%之間(RSD值為6.33%～9.61%)。符合生物樣本分析方法學要求。

2.7.4穩(wěn)定性實驗 取2.3項下各質(zhì)量控制溶液，各3份，按照2.5項下方法處理，得各質(zhì)量濃度質(zhì)量控制樣品，分別測定室溫(24 ℃)放置6 h穩(wěn)定性、4 ℃樣品架放置24 h穩(wěn)定性、長期凍存穩(wěn)定性(-80 ℃凍存放置10 d)以及3次凍融穩(wěn)定性(-80 ℃凍存放置大于24 h，取出解凍，再凍存大于24 h，反復3次)。結(jié)果表明，Sal B低、中、高質(zhì)量濃度在各穩(wěn)定條件下的RSD值分別為3.67%，1.84%，4.44%和6.92%；PF的RSD值分別為3.56%，4.04%，7.38%和8.08%；GL的RSD值分別為1.21%，2.32%，1.88%和3.96%。結(jié)果表明，樣品在室溫放置6 h穩(wěn)定，自動進樣器內(nèi)4 ℃樣品可放置24 h，凍融循環(huán)可進行3次，長期-80 ℃凍存可放置10 d。

表1精密度與準確度實驗結(jié)果

Tab.1 Results of precision and accuracy test

成分質(zhì)量濃度/mg·L-1日內(nèi)精密度檢測質(zhì)量濃度/mg·L-1平均回收率/%RSD/%日間精密度檢測質(zhì)量濃度/mg·L-1平均回收率/%RSD/%Sa1B0．060．06±0．00299．24．760．06±0．003100．25．963．133．13±0．23100．27．393．15±0．22100．76．874．694．81±0．29102．66．124．95±0．29105．75．93PF0．040．04±0．003100．48．310．04±0．00399．57．202．192．11±0．0496．51．932．22±0．1197．56．873．283．29±0．22100．56．633．40±0．1999．25．54GL0．120．12±0．00999．77．570．12±0．008102．06．956．256．10±0．4897．67．826．05±0．3896．56．339．389．13±0．8897．49．619．66±0．74103．47．66

2.7.5基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率 取2.3項下各質(zhì)量控制溶液，平行6份，按照2.5項下“正常處理”得到各質(zhì)量濃度的質(zhì)量控制樣品。進樣分析得到相應(yīng)色譜峰面積(A)；取6份不同來源基質(zhì)，參考2.5項下“基質(zhì)提取后加入處理”，進樣分析得到色譜峰面積(B)；參考2.5項“不含基質(zhì)處理”，獲得相應(yīng)峰面積(C)。提取回收率=A/C×100%，結(jié)果表明，Sal B低、中、高質(zhì)量濃度提取回收率分別為80.24%，84.43%和90.38%(RSD值為6.19%～7.31%)；PF提取回收率分別為100.43%，103.51%和107.63%(RSD值為2.42～5.74%)；GL提取回收率分別為92.08%，95.05%和98.17%(RSD值為6.75%～9.46%)。基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%。結(jié)果表明，Sal B低、中、高3個質(zhì)量濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為89.11%，86.90%和87.54%(RSD值為4.57%～10.16%)；PF的基質(zhì)效應(yīng)分別為89.21%，93.56%和97.43%(RSD值為5.38～7.44%)；GL的基質(zhì)效應(yīng)分別為91.74%，90.83%和95.62%(RSD值為7.12%～9.06%)。3種待測成分回收率高、基質(zhì)效應(yīng)小，符合方法學要求。

2.7.6稀釋方法學實驗 配制高于定量上限的Sal B、PF和GL大鼠血漿樣本，分別測定稀釋10倍后的樣品，用實測值乘以稀釋倍數(shù)后，計算質(zhì)量濃度是否為標示值的85%～115%,結(jié)果見表2。由表2可知，3種樣本稀釋10 倍不會影響測定的準確度。

2.8Sal B、PF和GL在大鼠體內(nèi)的藥動學 Sal B、PF和GL復配混合液經(jīng)大鼠尾靜脈注射給藥，各采血點樣品按照所建立的方法進行處理并測定血藥質(zhì)量濃度。按照動物種屬、給藥劑量、取樣時間點及測定的血藥質(zhì)量濃度結(jié)果數(shù)據(jù)采用WinNonlin 7.0藥動學軟件按照非房室模型進行處理，得到藥動學參數(shù)，見表3。平均血藥質(zhì)量濃度-時間曲線見圖3。

表2 稀釋精密度和準確度

表3 復配注射給藥后3種成分在大鼠血漿中的藥動學參數(shù)

由圖3可知，在此給藥劑量下，Sal B和PF在給藥6 h后血藥質(zhì)量濃度低于檢測下限，Sal B在45 min出現(xiàn)吸收峰，GL在45 和360 min有2個二次吸收峰，且在取樣時間內(nèi)血藥質(zhì)量濃度均可測到。

A.丹酚酸B；B.芍藥苷；C.甘草酸。

A.Sal B； B.PF； C.GL.

3 討論

多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring，MRM)在藥物代謝動力學研究中對生物復雜基質(zhì)中低質(zhì)量濃度樣品進行定量分析，可消除干擾。本研究采用內(nèi)標法進行定量，文獻報道丹酚酸B內(nèi)標選擇有氯霉素[7-8]、吲達帕胺[9]和對羥基苯甲酸[10]；芍藥苷的內(nèi)標物一般有咖啡因[11]、阿魏酸和梔子苷[12]等。本研究通過預試對比，建立了以氯霉素為內(nèi)標，在正負離子模式下，選擇梯度洗脫，同時測定大鼠血漿中3種成分含量，所建立方法分離度好、分析時間短、效率高。本文對比了不同血漿處理方法，結(jié)果乙酸乙酯-甲酸處理后甘草酸無檢測峰，丹酚酸B和芍藥苷的平均回收率分別為75.0%和84.2%；甲醇沉淀法處理后丹酚酸B無檢測峰，芍藥苷和甘草酸的平均回收率為74.8%和93.1%；參照文獻方法[13]采用乙腈-甲酸處理能使目標分析物達到理想的絕對回收率。

3種活性成分復配尾靜脈給藥中丹酚酸B的表觀分布容積較文獻報道偏低[14-15]，可能與文獻報道[16]丹酚酸B的與血漿蛋白結(jié)合率高(92.5%±1.5%)有關(guān)，也可能與復配給藥有關(guān)。丹酚酸B藥時曲線在45 min出現(xiàn)吸收峰，這可能與其能快速消除進入大鼠膽汁，并存在肝膽排泄途徑形成肝腸循環(huán)有關(guān)[17-20]。芍藥苷的半衰期縮短，體內(nèi)滯留時間與文獻[21-22]相比明顯減少，可能與配伍用藥有關(guān)。甘草酸注射給藥后，出現(xiàn)2個吸收峰，二次吸收時間與文獻報道[23]結(jié)果一致。

本研究建立了同時測定大鼠血漿中丹酚酸B、芍藥苷和甘草酸的液質(zhì)聯(lián)用方法，初步闡明了3種成分復配尾靜脈注射給藥的藥動學參數(shù)特征，為復配用藥的進一步研究應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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