高麗槐素的細(xì)胞毒性作用及其相關(guān)機(jī)制研究

陳 露，趙 靜，梁麗薇，高曉黎*

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室，烏魯木齊 830011)

高麗槐素(maackiain, 1.6α,12α-dihydro-6H-(1,3) dioxolo (5,6) benzofuro (3,2-c)(1) benzopyran-3-ol)又名馬卡因,化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。高麗槐素廣泛存在于紅車軸草[1]、牛大力[2]、錦雞兒[3]和苜蓿等植物中，其中苜蓿和紅車軸草是新疆常見的植物，多分布在草原或綠洲地帶，全國均有分布[4]。通過對(duì)文獻(xiàn)的收集整理發(fā)現(xiàn)，高麗槐素具有抗腫瘤活性[5]，抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和谷草芽孢桿菌[6]的分裂生長(zhǎng)以及鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SGLT-2)活性[7]。同時(shí)該物質(zhì)對(duì)雌激素受體無明顯活性，對(duì)脂代謝誘導(dǎo)的一氧化氮生成具有抑制作用和強(qiáng)效殺菌作用[8]。高麗槐素的現(xiàn)有研究結(jié)果表明，它具有抗菌、抗癌活性[9]以及芳香基抑制等作用；同時(shí)也有殺幼蟲作用[10]，能夠殺蟲，但對(duì)體外安全性的相關(guān)研究缺乏有力根據(jù)[11]。本文擬從細(xì)胞水平探討高麗槐素對(duì)心、肝、腎等細(xì)胞的增殖[12]、凋亡[13]和活性影響[14]。

圖1高麗槐素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Fig.1 The chemical structure of maackiain

1 儀器與材料

1.1儀器 Milli-Q Academic超純水儀(Millipore公司)；冷凍離心機(jī)(法國Jouan公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司)；Sartorius BAS220天平(德國賽多利斯集團(tuán))；酶標(biāo)儀(Perkin Elmer公司)；DK-S22型水浴鍋(上海精科公司)；低溫冰箱(海爾公司)；熒光倒置顯微鏡(Zeiss公司)；紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)等。

1.2試藥 高麗槐素(成都曼思特生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)；DMEM培養(yǎng)基(高糖)，PBS緩沖液，胰蛋白酶，優(yōu)級(jí)牛血清(Hyclone公司)；噻唑藍(lán)(MTT，廣州賽國生物科技有限責(zé)任公司)；HOE33342染色試劑(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；TUNEL凋亡試劑盒(Roche公司)；LDH、AST、ALT和CK試劑盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.3細(xì)胞 H9C2(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供)；VSMC和HEK293細(xì)胞(國家藥物篩選中心提供)；L-02細(xì)胞(新疆華世丹藥物有限公司提供)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) H9C2、L-02、HEK293和VSMC細(xì)胞培養(yǎng)在胎牛血清(FBS)，加有100 u·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于恒溫箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察并根據(jù)生長(zhǎng)情況換液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且達(dá)到目標(biāo)數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[15]。

2.2MTT法 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞觀察計(jì)數(shù)，每毫升4×104個(gè)細(xì)胞，若計(jì)數(shù)超出即稀釋至該細(xì)胞密度，在96孔板中接種90 μL細(xì)胞液。37 ℃孵育24 h后，分別加入不同濃度的高麗槐素溶液(0.1,1,5,10,50,100,200,250和300 μmol·L-1)。相同孵育條件下每組6復(fù)孔，每孔10 μL，正常細(xì)胞為對(duì)照組。72 h后，取出96孔板吸去上清培養(yǎng)液。每孔加入質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的 MTT溶液100 μL，4 h后棄液，加入100 μL二甲基亞砜(DSMO)，緩慢振搖，15 min后在570 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值A(chǔ)[16]，抑制率= (1-給藥組A值/對(duì)照組A值)×100%。

2.3HOE33342熒光細(xì)胞核染色法 將4種細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)接種于96孔板，相同環(huán)境下孵育24 h后，分別給予高麗槐素低(1 μmol·L-1)、中(50 μmol·L-1)和高濃度(300 μmol·L-1)。置于37 ℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。每組6復(fù)孔，完全培養(yǎng)基作為對(duì)照組，每孔10 μL。72 h后棄液再加入加多聚甲醛溶液，固定15 min后棄液并用HOE33342試劑染色15 min，固定，觀察細(xì)胞凋亡情況[17]。

2.4TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞H9C2、L-02、HEK293和VSMC，以2×104個(gè)·mL-1接種于12孔板中，每孔2 mL細(xì)胞懸浮液。在37 ℃孵育24 h后，分別給予低、中、高濃度(1，50和300 μmol·L-1)的高麗槐素，方法嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒說明書。分別加入反應(yīng)混合液，濕盒內(nèi)孵育，1 h后用PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min；再加50 μL 過氧化物酶 (POD) 培養(yǎng)，孵育60 min后取出，同樣用PBS緩沖液沖洗；再加入50 μL的二氨基聯(lián)苯胺(新配制)3～5 min，觀察細(xì)胞凋亡情況[18]，凋亡率為染色呈陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值，用百分比表示。

2.5高麗槐素對(duì)細(xì)胞酶活性的影響 細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將每毫升4×104個(gè)細(xì)胞數(shù)的懸浮液接種于96孔板90 μL，37 ℃孵育，24 h后給予低、中和高濃度(1，50和300 μmol·L-1)的高麗槐素。將無高麗槐素作為空白對(duì)照組，72 h后，棄去上清液，按照LDH、ALT、AST和CK的試劑盒說明書，根據(jù)參考文獻(xiàn)方法，檢測(cè)酶活性[19-20]。

3 結(jié)果

3.1高麗槐素對(duì)細(xì)胞增殖的影響 濃度范圍在0.1～300 μmol·L-1的高麗槐素作用4種細(xì)胞72 h后，細(xì)胞增殖率結(jié)果表明：(1)0.1～300 μmol·L-1時(shí)可促使大鼠心肌細(xì)胞H9C2增殖(P<0.05)，且在0.1～100 μmol·L-1時(shí)H9C2細(xì)胞增殖明顯(P<0.01)；(2)0.1～5 μmol·L-1時(shí)，高麗槐素對(duì)人胚肝細(xì)胞L-02差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，10～300 μmol·L-1時(shí)，L-02細(xì)胞增殖明顯(P<0.01)；(3)0.1～5 μmol·L-1時(shí)，對(duì)HEK293細(xì)胞無抑制作用；但濃度在10～300 μmol·L-1時(shí)，具有抑制作用(P<0.05)，同時(shí)表現(xiàn)劑量依賴性；(4)0.1～300 μmol·L-1時(shí)高麗槐素對(duì)VSMC細(xì)胞有抑制，且作用顯著(P<0.01)，但不呈現(xiàn)趨勢(shì)性，結(jié)果表明，在濃度為200 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞抑制影響較大。見圖2。

圖2高麗槐素對(duì)細(xì)胞的增殖作用

注：與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01，n=6。

Fig.2 The effects of maackiain on cell proliferation

Note：compared with the control group*P<0.05，**P<0.01，n=6.

3.2HOE33342熒光細(xì)胞核染色法檢測(cè)細(xì)胞在高麗槐素作用下的凋亡情況 檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果通過熒光倒置顯微鏡觀察，濃度為1，50和300 μmol·L-1高麗槐素作用后的H9C2 和L-02細(xì)胞的細(xì)胞核完整，凋亡現(xiàn)象較少；濃度為50和300 μmol·L-1高麗槐素與HEK293細(xì)胞作用后，與空白對(duì)照組細(xì)胞比較，出現(xiàn)凋亡小體。結(jié)果表明，高麗槐素在50 μmol·L-1以上濃度條件下會(huì)促進(jìn)HEK293細(xì)胞凋亡。在1～300 μmol·L-1時(shí)，VSMC細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡情況，對(duì)該細(xì)胞有影響。見圖3。

3.3TUNEL法檢測(cè)高麗槐素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 高麗槐素在各濃度組下(1，50和300 μmol·L-1)H9C2和L-02細(xì)胞經(jīng)觀察細(xì)胞核完整、無明顯的皺縮現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)高麗槐素濃度50和300 μmol·L-1與HEK293和VSMC細(xì)胞作用下，與空白對(duì)照組細(xì)胞相比，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核縮小有碎裂現(xiàn)象，出現(xiàn)凋亡小體，細(xì)胞凋亡且凋亡率降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4和圖5。

圖3高麗槐素作用下的細(xì)胞凋亡情況(HOE33342，×20)

Fig.3 The effects of maackiain on cell apoptosis (HOE33342，×20)

圖4高麗槐素作用下的細(xì)胞凋亡情況顯微圖(TUNEL，×20)

Fig.4 Micrograph of the effects of maackiain on cell apoptosis (TUNEL，×20).

圖5高麗槐素對(duì)細(xì)胞的凋亡作用

注：與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01，n=6。

Fig.5 The effects of maackiain on cell apoptosis

Note：compared with the control group*P<0.05，**P<0.01，n=6.

3.4高麗槐素對(duì)LDH的影響 細(xì)胞H9C2、L-02在高麗槐素1，50和300 μmol·L-1濃度下，乳酸脫氫酶(LDH)的活性變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高麗槐素濃度在50和300 μmol·L-1時(shí)，HEK293和VSMC細(xì)胞與空白對(duì)照組比較，細(xì)胞上清液隨濃度的增大LDH活性提高(P<0.05)。見圖6。

圖6高麗槐素對(duì)LDH的影響

注：與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01，n=3。

Fig.6 The effects of maackiain on LDH in cell culture medium

Note：compared with the control group*P<0.05，**P<0.01，n=3.

3.5高麗槐素對(duì)ALT、AST和CK的影響 與對(duì)照組比較，高麗槐素濃度在1，50和300 μmol·L-1時(shí)H9C2細(xì)胞酶活性(AST和CK)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；L-02細(xì)胞對(duì)ALT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在1，50和300 μmol·L-1濃度組中，濃度為50 μmol·L-1時(shí)AST活性顯著降低(P<0.05)，其余2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖7。

圖7高麗槐素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、ALT和CK的影響

注：與對(duì)照組比較*P<0.05，n=3。

Fig.7 The effects of maackiain on AST，ALT and CK in cell culture medium

Note：compared with the control group*P<0.05，n=3.

4 討論

高麗槐素是異黃酮類化合物，與細(xì)胞的增殖及凋亡情況有關(guān)，根據(jù)各細(xì)胞的自身細(xì)胞形態(tài)以及采用方法，結(jié)果可能呈現(xiàn)不同特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選用4種正常細(xì)胞進(jìn)行考察，初步研究高麗槐素的體外安全性，進(jìn)一步預(yù)測(cè)心肌、肝、腎和血管平滑肌功能的作用。

體外細(xì)胞毒性通常是考察受試藥物對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡以及經(jīng)酶作用后的影響，MTT法檢測(cè)高麗槐素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)是否具有抑制作用，可以初步判斷藥物對(duì)正常細(xì)胞的影響。通過實(shí)驗(yàn)可看出高麗槐素在一定濃度下對(duì)HEK293和VSMC細(xì)胞有抑制作用；驗(yàn)證高麗槐素對(duì)H9C2、L-02、HEK293和VSMC 4種細(xì)胞核形態(tài)及凋亡的影響，結(jié)果顯示，對(duì)L-02和H9C2細(xì)胞無影響，對(duì)HEK293和VSMC細(xì)胞在高濃度條件下有抑制作用，與MTT法結(jié)果基本相符；在考察了高麗槐素對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的基礎(chǔ)上，用酶活性進(jìn)一步考察與細(xì)胞膜是否完整的相關(guān)性。

綜上所述，通過高麗槐素在體外對(duì)4種細(xì)胞的毒性作用考察，不難看出，高麗槐素對(duì)心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用無影響，證明了該物質(zhì)在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)體外無毒性作用；同時(shí)人胚腎細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)高劑量組呈現(xiàn)細(xì)胞抑制和凋亡現(xiàn)象，說明該物質(zhì)在高麗槐素濃度高時(shí)有一定毒性作用。首次對(duì)高麗槐素的體外安全性初步研究提供了參考，為具有該物質(zhì)活性成分的藥物早期開發(fā)提供了理論依據(jù)。

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