黑番茄濃縮漿HPLC指紋圖譜研究及7個成分的定量分析

肖會敏，雷美娜，何 悅，柴在軍，王四旺*

(1.空軍軍醫(yī)大學藥學院藥物研究所，西安 710032；2.甘肅大漠紫光生物科技有限公司，蘭州 730030)

黑番茄(Black tomato)屬于被子植物門雙子葉植物綱茄目茄科番茄屬，原產(chǎn)南美洲，后經(jīng)德國、美國專家研究培育成優(yōu)質(zhì)種籽[1]。黑番茄有“沙漠黑金剛”之稱，是番茄家族的珍品，因其果色和果實均為紅黑色而得名[2-3]。黑番茄含有大量的茄紅素，豐富的維生素C和抗氧化物質(zhì)，易被人體吸收，具有預防前列腺癌、心臟病、乳腺癌、子宮頸癌和結(jié)腸癌等功效，預防乳腺癌效果顯著[4-7]。本課題前期研究證實，黑番茄對慢性前列腺炎及性機能有明顯的改善作用。2003年甘肅大漠紫光生物科技有限公司與美國技術(shù)合作后，在2008年成為了繼德國、美國之后全球第3個種籽生產(chǎn)基地，并向國內(nèi)外提供鮮果生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)種籽，于2010年建成了全球首條黑番茄生產(chǎn)加工線。隨著其營養(yǎng)價值被認知以及經(jīng)濟與環(huán)保價值的顯現(xiàn)，種植范圍越來越廣，研究越來越多[4,8]，但到目前為止尚無黑番茄功效成分分析的報道，本研究以甘肅大漠紫光生物科技有限公司提供的黑番茄濃縮漿為實驗材料，建立其指紋圖譜，測定主要化學成分，為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制及其后續(xù)功效評價奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2010 CHT高效液相色譜儀，LC/Labsoluion色譜工作站(日本島津公司)；ME235S電子分析天平(德國賽多利斯公司)；KQ-5200DE數(shù)控超聲波發(fā)生器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 沒食子酸(批號110831-201605，質(zhì)量分數(shù)90.8%)、綠原酸(批號110753-201415，質(zhì)量分數(shù)96.2%)、阿魏酸(批號110773-201614，質(zhì)量分數(shù)99.0%)、白藜蘆醇(批號111535-201703，質(zhì)量分數(shù)99.4%)、槲皮素(批號100081-201610，質(zhì)量分數(shù)99.8%)、木犀草素(批號111520-201605，質(zhì)量分數(shù)99.6%)和山柰酚(批號110861-201611，質(zhì)量分數(shù)95.5%)對照品，均購自中國食品藥品檢定研究院；黑番茄濃縮漿(500 g·袋-1)，批號:20170606(S1)，20170607(S2)，20170608(S3)，20170609(S4)，20170610(S5)，20170611(S6)，20170612(S7)，20170613(S8)，20170614(S9)，20170615(S10)，由甘肅大漠紫光生物科技有限公司提供；乙腈、甲醇，色譜級，美國Honeywell公司；超純水，自制。

2 指紋圖譜的測定方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Intersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：乙腈(A)-1.0 g·L-1磷酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～50 min，95%→90%B；50～100 min，90%→85%B；100～120 min，85%→60%B；120～135 min，60%→30%B；135～140 min，30%→0%B。記錄時間為140 min。流速：0.8 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；進樣量：20 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液 精密稱取綠原酸對照品5.0 mg，置于50 mL量瓶中,加體積分數(shù)為70%的甲醇定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的對照品溶液(參比物溶液)。

2.2.2供試品溶液 精密稱取本品濃縮漿10.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入體積分數(shù)為90%的甲醇10 mL，將錐形瓶密塞后稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 kW，頻率40 kHz)30 min，放冷后再稱定質(zhì)量，加入體積分數(shù)為90%的甲醇補足減失的質(zhì)量，振勻,濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3方法學考察

2.3.1精密度實驗 吸取2.2.2項下制備的供試品溶液(批號20170606)，連續(xù)進樣6次，分別對樣品中30個共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行分析。結(jié)果顯示，30個共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值分別小于2.0%和3.0%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性實驗 吸取2.2.2項下方法制備供試品溶液(批號20160606)，分別于0，3，6，9，15和24 h進樣，對樣品譜圖中30個共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行考察。結(jié)果顯示，樣品色譜圖中30個共有峰相對保留時間與相對峰面積的RSD值分別小于2.0%和3.0%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3重復性實驗 取6份供試樣品(批號20170606)，按照2.2.2項下方法制備的供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進行分析，分別對譜圖中30個共有峰的相對保留時間以及相對峰面積進行分析。結(jié)果顯示，30個共有峰相對保留時間與相對峰面積的RSD值分別小于2.0 %和3.0 %，結(jié)果表明，該方法重復性良好。

2.3.4指紋圖譜的建立及相似度分析 取10批黑番茄樣品，分別按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進樣分析，進樣量為20 μL，記錄指紋圖譜，見圖1。由圖1可知，圖譜中峰11為綠原酸，即參比物，以此建立指紋圖譜。10批樣品的譜圖中，30個共有色譜峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值分別小于2.0%和3.0%，與指紋圖譜研究技術(shù)的相關(guān)要求相符合，見圖1至圖2[9-10]。通過運用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A)對10批黑番茄濃縮漿的指紋圖譜進行相似度分析，結(jié)果顯示，通過對選定的30個共有色譜峰進行譜峰匹配，得出了樣品指紋圖譜的共有模式。譜圖中各峰整體相似度為0.972～0.995；結(jié)果表明，這10批黑番茄濃縮漿中的化學成分具有良好的一致性。

圖1黑番茄濃縮漿HPLC指紋圖譜

1～30.特征指紋峰；1.沒食子酸；11.綠原酸；17.阿魏酸；18.木犀草素；21.白藜蘆醇；24.槲皮素；26.山柰素。

Fig.1 Black tomato concentrated sauce HPLC fingerprint

1-30.characteristic fingerprint peaks；1.gallic acid； 11.chlorogenic acid；17.ferulic acid；18.luteolin；21.resveratrol；24.quercetin；26.kaempferol.

圖210批黑番茄濃縮漿的HPLC指紋圖譜

Fig.2 10 batches of Black tomato concentrated sauce HPLC fingerprint

3 含量測定方法與結(jié)果

3.1色譜條件 色譜柱為Intersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-1.0 g·L-1磷酸水溶液(B)；梯度洗脫同2.1項下。記錄時間為140 min。流速：0.8 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：325 nm；進樣量：20 μL。

3.2混合對照品溶液的制備 分別精密稱取阿魏酸、木犀草素和山柰酚5.1，5.0和5.2 mg，置于同一25 mL量瓶中，加體積分數(shù)為70%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液為A溶液；另精密稱取沒食子酸、綠原酸、白藜蘆醇和槲皮素9.6，26.0，5.0和 7.5 mg，置于同一25 mL量瓶中，精密加入A溶液1 mL，再加入體積分數(shù)為70%的甲醇定容至刻度，搖勻，得沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚對照品質(zhì)量濃度分別為350.00，1 000.00，20.00，20.00，200.00，300.00和20.00 μg·mL-1的混合對照品溶液。

3.3供試品溶液的制備 同2.2.2項下方法進行制備。

3.4線性關(guān)系 分別精密量取3.2項下制備的混合對照品溶液0.01，0.10，0.20，0.40，0.80和1.00 mL，分別置于1 mL量瓶中，加入體積分數(shù)為70%的甲醇稀釋至刻度，用0.22 μm微孔濾膜濾過，進樣。以各對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)，計算，得線性方程，見表1，色譜圖見圖3。結(jié)果表明，各對照品在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1對照品的線性方程及其質(zhì)量濃度范圍

Tab.1 Linear equations and their concentration ranges of the reference substance

對照品名稱線性范圍/μg·mL-1線性方程 r沒食子酸3．50～350．00y1=602．97x1+530．470．9996綠原酸10．00～1000．00y2=32213x2-609750．9996阿魏酸0．20～20．00y3=66388x3-5008．600．9993木犀草素0．20～20．00y4=14113x4-662．180．9995白藜蘆醇2．00～200．00y5=78161x5-118070．9997槲皮素3．00～300．00y6=38184x6+2528．900．9997山柰酚2．00～20．00y7=25492x7-2451．500．9996

3.5精密度實驗 精密吸取2.2.2項下制備的供試品溶液(批號20170606)，重復進樣5次，測得沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚的RSD值分別為1.00%，0.75%，1.12%，0.89%，0.96%，0.93%和0.81%，結(jié)果表明，該方法精密度良好。

圖3混合對照品HPLC圖譜

1.沒食子酸；2.綠原酸；3.阿魏酸；4.木犀草素；5.白藜蘆醇；6.槲皮素；7.山柰素。

Fig.3 Mixed reference substance HPLC fingerprint

1.gallic acid；2.chlorogenic acid；3.ferulic acid；4.luteolin；5.resveratrol；6.quercetin；7.kaempferol.

3.6穩(wěn)定性實驗 精密吸取2.2.2項下制備的供試品溶液(批號20170606)，分別在第0，2，4，8，12和24 h進樣。結(jié)果沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚峰面積的RSD值分別為0.82%，0.92%，0.83%，0.87%，0.95%，0.77%和0.81%，結(jié)果表明，該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7重復性實驗 精密稱取6份供試品(批號20170606)，分別按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照3.1項下色譜條件進樣測定分析。結(jié)果表明，6份供試品中沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚的平均含量分別為55.81，360.87，0.98，24.51，84.58，1.03和0.76 μg·g-1，RSD值分別為0.98%，1.05%，1.0%，1.04%，1.06%，0.92%和1.11%，結(jié)果表明，該方法重復性良好。

3.8加樣回收率實驗 精密稱取黑番茄濃縮漿(批號20170606)4.0 g，分別添加混合對照品溶液(精密稱取沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚適量，制成每1 mL體積分數(shù)為70%的甲醇中分別含上述物質(zhì)110.00，730.00，2.00，50.00，170.00，2.10和1.50 μg的混合對照品溶液)，再加入體積分數(shù)為70%的甲醇定容至刻度，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液6份，按照3.1項下色譜條件進樣測定，見表2。結(jié)果表明，該方法回收率良好。

表2加樣回收率測定結(jié)果

Tab.2 Results of sample recovery test

化合物樣品量/g原有量/mg加入量/mg測定量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%沒食子酸2．01240．11230．08800．198197．4399．370．772．02530．11300．08800．200299．012．03820．11380．11000．2239100．142．00110．11170．11000．220498．812．06400．11520．13200．2501102．172．00690．11200．13200．242298．66綠原酸2．01240．72620．58401．290496．6197．280．462．02530．73090．58401．303998．132．03820．73550．73001．449997．852．00110．72210．73001．421695．822．06400．74480．87601．609798．732．00690．72420．87601．569996．54阿魏酸2．01240．00200．00160．003596．7496．490．922．02530．00200．00160．003597．202．03820．00200．00200．004098．132．00110．00200．00200．003893．952．06400．00200．00240．004498．222．00690．00200．00240．004294．72白藜蘆醇2．01240．04930．04000．087595．4796．230．642．02530．04960．04000．087795．202．03820．05000．05000．098396．712．00110．04910．05000．096995．772．06400．05060．06000．109798．472．00690．04920．06000．106795．77槲皮素2．01240．17020．13600．303197．6898．360．542．02530．17130．13600．306499．312．03820．17240．17000．341199．252．00110．16930．17000．333496．562．06400．17460．20400．3790100．182．00690．16970．20400．368097．19木犀草素2．01240．00210．00170．003795．6796．760．692．02530．00210．00170．003796．072．03820．00210．00210．004197．172．00110．00210．00210．004196．142．06400．00210．00250．004698．972．00690．00210．00250．004596．54山柰酚2．01240．00150．00120．002798．3899．690．632．02530．00150．00120．0027100．062．03820．00160．00150．0031101．402．00110．00150．00150．003097．942．06400．00160．00180．0034101．192．00690．00150．00180．003399．15

3.9含量測定 精密量取10批供試品，分別按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照3.1項下色譜條件進樣分析。各批樣品中沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚的平均含量及RSD值分別見圖4和表3。

圖4黑番茄濃縮漿樣品HPLC圖

1.沒食子酸；2.綠原酸；3.阿魏酸；4.木犀草素；5.白藜蘆醇；6.槲皮素；7.山柰素。

Fig.4 HPLC fingerprint of Black tomato concentrated sauce samples

1.gallic acid；2.chlorogenic acid；3.ferulic acid；4.luteolin；5.resveratrol； 6.quercetin；7.kaempferol.

表3 10批黑番茄濃縮漿中7個成分含量測定結(jié)果

4 討論

采用二極管陳列檢測器全波長對黑番茄濃縮漿樣品進行檢驗測定，依據(jù)三維色譜圖，以及對各對應(yīng)波長下峰的信息量的比較，結(jié)果表明，波長為280 nm時峰的信息量較多，故將其作為該HPLC指紋圖譜的定性波長[11-14]；而在325 nm波長處時沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚7個化合物與相鄰各峰之間的分離度均≥1.5[15]，故將其作為該HPLC法測定7個化合物的定量波長。由于該保健食品成分復雜，等度洗脫難以充分洗脫，故采用梯度洗脫的方法。通過對不同流動相系統(tǒng)乙腈-磷酸水溶液、乙腈-醋酸水溶液、甲醇-水和乙腈-水進行比較，結(jié)果顯示，乙腈-1.0 g·L-1磷酸水溶液為理想流動相[16]。本制劑為果漿，選用溶劑為不同體積分數(shù)的甲醇(50%，60%，70%，80%，90%和100%)，結(jié)果顯示使用體積分數(shù)為90%的甲醇時分離較佳；采用不同時間(10，15，20，30，40，50和60 min)超聲或加熱回流，結(jié)果顯示超聲30 min較理想。對不同柱溫與流速進行比較，顯示柱溫超過或低于30 ℃時，譜圖中大部分色譜峰分離度小或不能分開；當流速高于或低于0.8 mL·min-1時，大部分色譜峰的分離度差；色譜記錄時間，在140 min之后，無色譜峰出現(xiàn)。因此，選擇便于控制的柱溫30 ℃，流速0.8 mL·min-1和記錄時間140 min。

綜上所述，通過對10批次的黑番茄濃縮漿樣品進行相似度計算分析，結(jié)果顯示相似度數(shù)值為0.972～0.995。同時，樣品中7種成分的定量結(jié)果顯示，各批次樣品中上述7種成分的含量均一且穩(wěn)定。表明筆者建立的黑番茄濃縮漿的HPLC指紋圖譜方法與含量測定方法，具有良好的分析及評價能力，具有簡便、穩(wěn)定可靠、準確等明顯優(yōu)勢。因此，該方法可用于黑番茄濃縮漿化學成分的含量檢測，其指紋圖譜適用于該保健食品的質(zhì)量控制等評價方法。

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