定西市黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌生物學(xué)特性研究

丁文姣，于安芬，李瑞琴，徐 瑞，白 濱

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070）

黃芪普遍種植于甘肅各地，尤以甘肅中部的定西等地最多［1-4］。近年來，隨著中藥產(chǎn)業(yè)化的不斷發(fā)展，黃芪種植面積也不斷擴(kuò)大，輪作周期縮短，連作面積增加，導(dǎo)致黃芪根腐病越來越嚴(yán)重。根腐病危害的黃芪植株，其地上部生長衰弱，地下部被害主、側(cè)根出現(xiàn)褐色壞死病斑，嚴(yán)重時(shí)根皮腐爛呈纖維狀，直接影響黃芪的產(chǎn)量和品質(zhì)。我們?cè)趯?duì)甘肅中部地區(qū)黃芪根腐病原的研究中發(fā)現(xiàn)，茄病鐮刀菌（Fusarium solani）是該區(qū)域黃芪根腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌。為探明黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌生長發(fā)育與溫度、光照、酸堿度和營養(yǎng)等生物學(xué)因子的關(guān)系，對(duì)來源于甘肅中部地區(qū)黃芪根腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌茄病鐮刀菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，以期為黃芪無公害生產(chǎn)和根腐病綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌及來源

供試黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌茄病鐮刀菌（F.solani）菌株為2014—2015年從甘肅省定西市4個(gè)縣13個(gè)鄉(xiāng)黃芪產(chǎn)區(qū)采集的15份黃芪根腐病株標(biāo)樣上分離，通過單孢純化得到純培養(yǎng)，根據(jù)Burgess等［5］與 Neson 等［6］的分類系統(tǒng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下鑒定，用柯赫氏法致病性試驗(yàn)證明其致病性后置于-20℃冰箱保存，試驗(yàn)前在PDA平板上活化待用。

1.2 供試培養(yǎng)基種類

供試培養(yǎng)基為以下集中培養(yǎng)基［7-8］，PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂13 g、水1 000 mL?；A(chǔ)培養(yǎng)基：KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、K2HPO41.0 g、 MgSO4·7H2O 0.5 g、KNO32.0 g、葡萄糖30 g、瓊脂13 g、蒸餾水1 000 mL。

1.3 菌種擴(kuò)繁

將活化的菌種接種于PDA平板上，25℃下擴(kuò)繁生長5 d，用于生物學(xué)特性的研究。

1.4 生物學(xué)特性

1.4.1 溫度對(duì)黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌生長和產(chǎn)孢的影響 將擴(kuò)繁菌種用直徑為6 mm的打孔器打成菌餅，接種于PDA平板中央，分別置于5、10、15、20、25、30、35、40℃共8個(gè)梯度下于黑暗條件下培養(yǎng)，3次重復(fù)。3 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，取其平均值。5 d后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算產(chǎn)孢量［7-10］。

1.4.2 pH對(duì)黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌生長和產(chǎn)孢的影響 用濃度為1～10 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉溶液配制pH分別為5、6、7、8、9、10等6個(gè)酸堿度梯度的PDA培養(yǎng)基。用直徑為6 mm的菌餅分別接種于不同pH的PDA平板中央，3次重復(fù)，25℃黑暗條件下培養(yǎng)，其余同1.4.1［7-10］。

1.4.3 光照對(duì)黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌生長和產(chǎn)孢的影響 在人工氣候箱內(nèi)設(shè)置24 h連續(xù)黑暗、24 h連續(xù)熒光、12 h連續(xù)黑暗＋12 h連續(xù)熒光交替處理共3種光照條件，將6 mm的菌餅接種于PDA平板中央，分別置于以上條件的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，3次重復(fù)。其余同1.4.1［7-10］。

1.4.4 不同碳源對(duì)黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌生長和產(chǎn)孢的影響 用蔗糖、甘露醇、乳糖、山梨醇、D-果糖、木糖、L-山梨糖、鼠李糖、麥芽糖替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，配制不同碳源的固體培養(yǎng)基，設(shè)不添加碳源為對(duì)照。將6 mm的菌餅接種于平板中央，分別置于25℃黑暗條件下培養(yǎng)培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)。其余同1.4.1［7-10］。

1.4.5 不同氮源對(duì)黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌生長和產(chǎn)孢的影響 用蛋白胨、DL-甲硫氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、谷氨酸鈉、甘氨酸、賴氨酸替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的KNO3，配制不同氮源的固體培養(yǎng)基，設(shè)添加氮源KNO3為對(duì)照。將6 mm的菌餅接種于平板中央，分別置于25℃黑暗條件下培養(yǎng)培養(yǎng)，3次重復(fù)。其余同1.4.1［7-10］。

1.5 黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌致死溫度的測(cè)定

利用恒溫水浴的方法測(cè)定致死溫度。將6 mm菌餅接入規(guī)格為15 mm×200 mm的滅菌試管中，每管裝10 mL滅菌蒸餾水，接入3個(gè)菌餅。分別在40、45、50、55、60℃的恒溫水浴鍋中處理10 min，處理時(shí)緩慢搖動(dòng)試管使之受熱均勻。將不同溫度處理后的菌餅用滅菌挑針挑出接入PDA平板上，置25℃恒溫箱中保暗培養(yǎng)，5 d后觀察有無菌落生長。3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度條件下黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌生長情況和產(chǎn)孢量

通過表1可以看出，在測(cè)試溫度范圍內(nèi)，黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌在不同溫度下的菌落生長量和產(chǎn)孢量差異顯著。病原菌在溫度為5～40℃時(shí)均能生長，生長適宜溫度范圍為20～30℃，最適為25℃，菌落直徑為（28.33±0.22）mm。在10～30℃時(shí)均能產(chǎn)孢，產(chǎn)孢適宜溫度為20～30℃，最適為25℃，產(chǎn)孢量為（5.92±1.22）×108個(gè)/皿，5℃和35℃下則未見產(chǎn)孢。

表1 不同溫度下黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌的生長情況和孢子量①

2.2 不同酸堿條件下黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌生長情況和產(chǎn)孢量

在pH為5～10的酸堿度范圍內(nèi)，黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病菌都能生長。隨pH的升高，菌落直徑呈先增大后減小趨勢(shì)，以pH為5～8時(shí)生長較好，菌落直徑間無顯著差異；pH高于8時(shí)生長減慢。產(chǎn)孢量則以pH為6～7時(shí)最多，其中pH為6時(shí)最高，為（3.80±1.99）×108個(gè)/皿。

表2 不同pH下黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌的生長情況和孢子量

2.3 不同光照條件下黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌生長情況和產(chǎn)孢量

從圖1可以看出，在設(shè)置的3種光照處理中，以黑暗條件下菌落生長較快，說明黑暗條件利于菌絲的生長。但統(tǒng)計(jì)分析表明，不同光照處理間菌落生長量差異并不顯著，說明設(shè)置的3種光源對(duì)其生長無顯著影響。在對(duì)產(chǎn)孢量的影響方面，以24 h連續(xù)熒光下的產(chǎn)孢量最大，其次為12 h光暗交替，24 h連續(xù)黑暗下的產(chǎn)孢量最低。統(tǒng)計(jì)分析表明，光照處理間對(duì)產(chǎn)孢的影響有顯著差異，說明光照條件能促進(jìn)產(chǎn)孢。

圖1 不同光照下黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌的生長情況和孢子量

2.4 不同碳、氮源對(duì)黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌生長情況及產(chǎn)孢量的影響

由表3可知，黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病菌對(duì)培養(yǎng)基中的9種碳源利用能力都較好，生長量差異不顯著。產(chǎn)孢量明顯不同，在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最大，其次為蔗糖、葡萄糖、甘露醇，在不添加碳源的培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢。黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病菌可不同程度地利用無機(jī)氮源和有機(jī)氮源，菌落生長直徑在蛋白胨、丙氨酸培養(yǎng)基上最大，在其余氮源上菌落直徑差異不顯著?？傮w來說對(duì)無機(jī)氮源利用能力較強(qiáng)。產(chǎn)孢量則以KNO3為氮源的培養(yǎng)基為最大，含亮氨酸和苯丙氨酸的培養(yǎng)基產(chǎn)孢能力最弱。

表3 不同碳、氮源對(duì)黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌生長情況和產(chǎn)孢量的影響

2.5 黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌的致死溫度

從表4可知，經(jīng)60℃及以上溫度恒溫水浴處理10 min的菌餅在PDA平板上均不再生長，表明病原菌致死溫度為60℃。

表4 黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌致死溫度測(cè)定結(jié)果①

3 小結(jié)與討論

研究表明，定西黃芪根部腐爛病的優(yōu)勢(shì)致病病原菌為腐皮鐮刀菌。病原菌在溫度為5～40℃、pH為5～10內(nèi)菌絲均能生長，生長的最適溫度為25℃，最適pH為5～8。菌絲致死溫度為60℃恒溫10 min。產(chǎn)孢最適溫度為25℃，5℃雖能緩慢生長，但不產(chǎn)生孢子。在pH為6時(shí)生長最快，產(chǎn)孢量最高。在全程光照條件下產(chǎn)孢量最多，在全程黑暗條件下菌絲生長最好。說明該菌對(duì)環(huán)境條件的適應(yīng)范圍較廣，菌絲生長和孢子產(chǎn)生的適宜條件及適應(yīng)范圍與甘肅黃芪栽培區(qū)的環(huán)境條件較為一致，且能夠利用多種單糖、多糖及醇類做碳源和硝酸銨、蛋白胨、甘氨酸、賴氨酸等多種無機(jī)氮和有機(jī)氮做氮源，在各種氮源碳源培養(yǎng)基上均能生長，對(duì)營養(yǎng)的要求不是很嚴(yán)格。這是甘肅地區(qū)黃芪根腐病近年來發(fā)病嚴(yán)重的原因之一。

黃芪根腐病是一種土傳病害，病菌可在土壤中逐年積累。根據(jù)黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌的生物學(xué)特性，對(duì)黃芪根腐病的防治應(yīng)以預(yù)防為主，綜合協(xié)調(diào)運(yùn)用以輪作為主的綜合措施，惡化病菌的生態(tài)條件，可減少病菌源數(shù)量，減輕根腐病危害，提高產(chǎn)量與品質(zhì)。

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