氟磺胺草醚抑制大豆根瘤固氮酶活性與碳代謝關系的研究

紀廣影，丁 偉，高文逸，趙慧凝

（東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院植保系，黑龍江哈爾濱150030）

大豆是我國重要的糧食作物之一［1］。大豆不同于其他非豆科植物的顯著特點是，土壤中的根瘤菌侵染根表皮細胞形成根瘤，將空氣中的N2逐步轉化為NH3并吸收利用進而完成蛋白質合成。大豆根瘤的共生固氮作用為大豆生長提供了重要的氮素來源，對大豆產(chǎn)量和品質提高具有非常重要的作用［2］。氟磺胺草醚是目前國內(nèi)大豆生產(chǎn)中最常用的除草劑之一，具有選擇性，主要用于旱田除草，在花生、大豆田中防除闊葉雜草極為有效。目前，關于除草劑對根瘤固氮影響的研究結果表明，除草劑可以破壞土壤微生物的生長環(huán)境，抑制根瘤的生長發(fā)育、結瘤及固氮能力［3－4］；除草劑抑制碳代謝，導致同化產(chǎn)物合成和運輸受到障礙，從而影響根瘤能量供應［5－7］。國內(nèi)的研究多集中在除草劑對根際環(huán)境、根瘤菌及根瘤生長發(fā)育的影響；國外的研究多側重于除草劑對根瘤固氮酶活性的影響，酰胺類除草劑異丙草胺和有機磷類除草劑草甘膦對根瘤固氮酶活性均有顯著的抑制作用［5，8－9］。關于氟磺胺草醚對大豆根瘤固氮影響的研究較少，但氟磺胺草醚仍是我國大豆生產(chǎn)中常用的除草劑之一。根瘤固氮作用在根瘤的類菌體中進行，這一化學反應需要光合作用合成的碳水化合物作為能源。本試驗以氟磺胺草醚對大豆光合碳代謝影響為切入點，研究不同劑量氟磺胺草醚對大豆葉片光合速率、根瘤細胞漿蔗糖含量、根瘤蔗糖合成酶活性的影響，及其與固氮酶活性的相關性，從而揭示氟磺胺草醚抑制大豆根瘤固氮活性的生理機制，以期為正確評價氟磺胺草醚對大豆的安全性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗在東北農(nóng)業(yè)大學校內(nèi)試驗基地進行，供試大豆品種為東農(nóng)50，供試除草劑為250 g／L氟磺胺草醚水劑。試驗共設2個處理，氟磺胺草醚施用劑量分別為337、675 g a.i.／hm2，并以未施氟磺胺草醚的處理作空白對照，每個處理4次重復。大豆于2016年5月2日播種，在大豆第3張復葉完全展開時，用250 g／L氟磺胺草醚水劑對莖葉進行處理。分別于施藥7、14、21、28 d后取樣，每個小區(qū)挖取10～15株大豆完整根系，帶回實驗室測定相關指標。

1.2 測定方法

1.2.1 光合速率的測定 采用美國產(chǎn)Li－6400XT便攜式光合速率測定儀測定大豆葉片光合速率。葉室CO2濃度設定為 400μmol／CO2mol，溫度為 22.5℃，空氣相對濕度為40% ～50%。施藥7、14、21、28 d后，在晴天 09：00—11：00，于每個處理小區(qū)中間2行隨機選3株大豆的相同部位測定完全展開葉片的光合速率。

1.2.2 固氮酶活性的測定 參照ZabLotowicz等的方法并經(jīng)過改進，利用日本島津GC－14C氣相色譜分析儀，采用乙炔還原法活體測定固氮酶活性［10－11］。取2根完整的大豆根系放入具塞血清瓶中，用橡皮塞封閉，先用注射器從瓶中抽出5.0 mL空氣，再向瓶中注入5.0mL乙炔氣體，28℃反應2 h，反應結束后，用微量進樣器分別抽取1.0mL反應瓶中的混合氣體，注入氣相色譜儀測定乙烯含量。

氣相色譜柱為長2 m的不銹鋼填充柱，固定相為GDX－502，氫火焰離子檢測器，柱溫為65℃，檢測室溫度為110℃，氣化室溫度為110℃；用N2做載氣，流量為35 mL／min；燃氣（H2）壓力為 0.8 kg／cm2，空氣壓力為 1.6 kg／cm2。

1.2.3 大豆根瘤細胞漿中蔗糖含量的測定 將大豆根瘤中心的類菌體去掉，剩余部分即為細胞漿，采用張志良等的間苯二酚比色法測定細胞漿內(nèi)的蔗糖含量［12］。

1.2.4 大豆根瘤蔗糖合成酶活性測定 粗酶液提取：取約1 g預冷樣品，加入3 mL提取介質（100 mmol pH值為7.2的Tris－HCl、10 mmol MgCl2、1 mmol乙二胺四乙酸二鈉、10 mmol疏基乙醇、2%乙二醇、1%交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，各0.5 mL）于研缽中快速研磨成均勻糊狀后，再用2 mL提取介質清洗研缽2次，倒入離心管中，12 000 r／min低溫冷凍高速離心機離心10 min。取上清液測定蔗糖合成酶合成方向的活性，以上過程均在4℃下進行。

蔗糖合成酶分解方向活性的測定：每個處理取4只試管，各加入0.2 mL粗酶液（對照加入 0.2 mL 2 mol／L NaOH），加0.6 mL分解反應介質（100 mmol pH值為7.2的 Tris－HCl、10 mmol MgCl2、5 mmol尿苷二磷酸葡萄糖、50 mmol蔗糖，各0.15 mL），在 30℃水浴 30 min后，再沸水浴 5 min，加入0.2 mL 2mol／LNaOH混勻，再加入0.5mL 3，5－二硝基水楊酸在沸水中加熱5 min，冷卻，再加入4 mL蒸餾水，在540 nm處比色［13］。

1.3 數(shù)據(jù)分析和計算

用Excel對試驗數(shù)據(jù)進行整理，用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 氟磺胺草醚對固氮酶活性的影響

由圖1可知，在施藥的28 d內(nèi)，氟磺胺草醚對根瘤固氮酶活性一直有抑制作用。337、675 g a.i.／hm2氟磺胺草醚對固氮酶活性的抑制率分別達12.42%～15.61%、18.30%～28.28%。337 g a.i.／hm2氟磺胺草醚在處理 21 d后時抑制率達到最高值，之后減??；675 g a.i.／hm2氟磺胺草醚在處理14 d后時抑制作用最強，在28 d后時抑制作用最弱。且高劑量處理下的抑制作用大于低劑量。

2.2 對光合速率的影響

2.2.1 氟磺胺草醚對光合速率的影響 由圖2可知，施用不同劑量的氟磺胺草醚后，對光合速率的抑制作用明顯，337 g a.i.／hm2氟磺胺草醚對光合速率的抑制率最高值達16.89%，675 g a.i.／hm2氟磺胺草醚對光合速率的抑制率最高值為20.19%，且都出現(xiàn)在施藥21 d后時，之后抑制作用減弱，光合速率恢復正常。

2.2.2 氟磺胺草醚對根瘤固氮酶活性影響與光合速率的關系 由圖3、圖4可知，2個劑量的氟磺胺草醚處理下，根瘤固氮酶活性與葉片光合速率在測定的時間點均呈正相關，分別在14、21 d后及21、28 d后呈顯著正相關，表明根瘤固氮酶活性高低與光合速率顯著相關。

2.3 對蔗糖含量的影響

2.3.1 氟磺胺草醚對根瘤細胞漿中蔗糖含量的影響 由圖5可知，施用氟磺胺草醚后，根瘤細胞漿中蔗糖含量與對照相比，均受到不同程度的抑制，337 g a.i.／hm2氟磺胺草醚在處理 14 d后時的抑制率最高，為 30.95%，675 g a.i.／hm2氟磺胺草醚在處理7 d后時的抑制率最高，為36.29%。且隨著施藥時間的延長，抑制作用逐漸減弱，蔗糖含量恢復正常。

2.3.2 氟磺胺草醚對根瘤固氮酶活性影響與根瘤細胞漿中蔗糖含量關系 由圖6、圖7可知，不同處理下固氮酶活性與根瘤細胞漿中蔗糖含量之間呈正相關；施用 675 g a.i.／hm2氟磺胺草醚時，在28 d后固氮酶活性與根瘤細胞漿中蔗糖含量之間呈顯著正相關，說明固氮酶活性與根瘤漿細胞中蔗糖的含量存在一定的相關關系。

2.4 對蔗糖合成酶的影響

2.4.1 氟磺胺草醚對根瘤蔗糖合成酶活性的影響 由圖8可知，在 337、675 g a.i.／hm2用量下，氟磺胺草醚對根瘤蔗糖合成酶活性的抑制率分別在21、14 d后時達到最高值，分別為33.08%、39.94%，隨著施藥時間的延長，抑制率逐漸減小，根瘤蔗糖合成酶活性逐漸恢復到正常水平，但高劑量處理下的抑制作用時間較長，恢復較慢。

2.4.2 氟磺胺草醚對根瘤固氮酶活性影響與根瘤蔗糖合成酶活性關系 由圖9、圖10可知，施用337 g a.i.／hm2氟磺胺草醚7、21 d后，固氮酶活性與根瘤蔗糖合成酶活性呈顯著正相關；施用675 g a.i.／hm2氟磺胺草醚，在測定的28 d內(nèi)固氮酶活性與根瘤蔗糖合成酶活性均呈顯著正相關。

3 結論與討論

氟磺胺草醚的作用靶標是植物體內(nèi)原卟啉原氧化酶，原卟啉原氧化酶固定于葉綠體內(nèi)，是催化葉綠素與亞鐵原卟啉生物合成最后階段的酶，此種酶被抑制可造成對光敏感的原卟啉原IX迅速積累［14］，在光合分子氧存在的條件下原卟啉原Ⅸ產(chǎn)生單態(tài)氧，使脂膜過氧化最終造成細胞死亡。氟磺胺草醚施藥1～3 d后，葉片有明顯的壞死斑點等藥害癥狀，說明葉片的光合作用受到影響［15］。

以碳的同化為核心的光合作用是植物生長發(fā)育過程中最基本的物質和能量來源，是碳代謝中的重要部分［16］。蔗糖是高等植物光合作用的主要產(chǎn)物，又是葉片光合產(chǎn)物向各器官運輸?shù)闹饕问剑?7］，而蔗糖合成酶既可以催化蔗糖的合成也可以催化蔗糖的分解，對植物體內(nèi)蔗糖的代謝起著至關重要的作用，代表著植物碳代謝的水平［18］。根瘤中的固氮作用在類菌體中進行，類菌體利用光合產(chǎn)物蔗糖呼吸作用產(chǎn)生電子及能量腺嘌呤核苷三磷酸，從而把還原成＋［19］。

氟磺胺草醚對根瘤細胞漿蔗糖含量的抑制作用在14 d后時最強，此時固氮酶活性明顯降低。施藥28 d后時，氟磺胺草醚對根瘤蔗糖合成酶活性的抑制作用最弱，與對照相比，細胞漿蔗糖含量無明顯差異。光合速率的高低也影響著固氮酶活性。同時發(fā)現(xiàn)，在高劑量（675 g a.i.／hm2）氟磺胺草醚處理下，各項指標受到的抑制作用更強且持續(xù)時間較長，正常劑量（337 g a.i.／hm2）氟磺胺草醚處理下根瘤固氮和碳代謝受到影響的程度要輕于高劑量，且之后可恢復正常水平。

本研究中，在氟磺胺草醚處理后，固氮酶活性與葉片光合速率呈顯著正相關，高劑量氟磺胺草醚處理下根瘤細胞漿蔗糖含量在28 d后與根瘤固氮酶活性呈顯著正相關，且氟磺胺草醚與根瘤蔗糖合成酶活性也呈顯著正相關。結果表明，固氮酶活性的變化受到葉片光合速率、根瘤細胞漿蔗糖含量及根瘤蔗糖合成酶活性的影響，大豆光合作用受到抑制，產(chǎn)生的能量減少，從而使根瘤細胞漿內(nèi)的蔗糖含量減少，根瘤蔗糖合成酶活性受到抑制，導致大豆根瘤固氮時可以利用的能源與碳源減少，根瘤固氮酶活性受到抑制。

施用氟磺胺草醚后，葉片光合速率、根瘤細胞漿中的蔗糖含量、根瘤根瘤蔗糖合成酶活性均與根瘤固氮酶活性呈正相關。碳代謝受到抑制，同化產(chǎn)物供應不足是氟磺胺草醚抑制固氮酶活性的重要原因。正常劑量的氟磺胺草醚對根瘤固氮和碳代謝有短時間的不利影響，后期可恢復。

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