超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定環(huán)境樣品中溴嘧氯草醚殘留及其在土壤中降解特性的研究

何紅梅+吳珉+張春榮+俞建忠+趙華+朱亞紅+何開雨+張昌朋+蔡磊明+徐玲英+唐慶紅

摘 要 建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）測定土壤、沉積物和水中溴嘧氯草醚殘留量的方法，研究了溴嘧氯草醚在3種不同類型土壤中的降解特性。樣品經(jīng)乙腈提取后，以C18固相萃取柱凈化，采用梯度洗脫程序、BEH C18色譜分離柱、應用UPLCMS/MS多反應監(jiān)測模式測定溴嘧氯草醚。對0.005、0.05 和2.0 mg/kg添加濃度樣品進行回收實驗，溴嘧氯草醚在土壤、沉積物和水中的平均回收率為87%～106%，變異系數(shù)為2.8%～8.0%。溴嘧氯草醚在0.5～20 μg/L濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)R2>0.9999，溴嘧氯草醚在土壤（沉積物）和水中的定量限分別為0.2 μg/kg和0.2 μg/L。應用建立的溴嘧氯草醚殘留分析方法檢測了土壤降解樣品，結(jié)果表明，溴嘧氯草醚在3種不同土壤中好氧降解的半衰期為1.72～28.2 d，厭氧降解的半衰期為2.93～31.4 d； 在同一種土壤樣品中，好氧條件下溴嘧氯草醚降解快于厭氧條件； 土壤中溴嘧氯草醚降解的快慢與土壤的pH值、陽離子交換量和土壤質(zhì)地有關(guān)。

1 引 言

2嘧啶氧基N芳基芐胺類衍生物是由中國科學院上海有機化學研究所和浙江省化工研究院有限公司共同發(fā)現(xiàn)的具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)和高效除草活性的農(nóng)藥先導化合物[1]，并已獲得多國專利授權(quán)[2]?；谠撓葘Щ衔?， 研究者已開發(fā)出新型高效油菜田除草劑農(nóng)藥新品種：丙酯草醚和異丙酯草醚[3～8]。溴嘧氯草醚（開發(fā)代號：SIOC0426，化學名稱為N[2氯6（4，6二甲氧基2嘧啶氧基）芐基]4溴苯胺，結(jié)構(gòu)式見圖1）是在對該先導化合物進行優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)的第一種除草活性高、殺草譜廣、對棉花和棉田主要雜草有良好選擇性的化合物，作為棉田除草劑候選品種具有良好的市場開發(fā)前景[2，9]。

圖1 溴嘧氯草醚的結(jié)構(gòu)式

Fig.1 Structure of SIOC0426 （ 4bromoN（ 2chloro6（ 4，6dimethoxypyrimidin2yloxy ）benzyl） aniline）

隨著農(nóng)藥的廣泛使用，農(nóng)藥與生態(tài)環(huán)境保護的矛盾日益突出，因此農(nóng)藥在環(huán)境中的殘留分析方法以及其土壤降解特性研究對農(nóng)藥環(huán)境安全性評價具有重大意義。雖然溴嘧氯草醚具有低毒和無致突變特性[9]，但缺乏關(guān)于它的環(huán)境危害或風險研究。目前，未見溴嘧氯草醚在土壤中降解特性的報道，環(huán)境樣品中溴嘧氯草醚殘留分析方法也鮮有報道。本研究建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測土壤、沉積物和水中溴嘧氯草醚殘留分析方法，為環(huán)境中該藥物檢測提供了參考方法； 同時，首次進行了溴嘧氯草醚在土壤上的降解特性研究，揭示了該藥物在環(huán)境土壤中的降解特性，為該藥物的環(huán)境安全性評價提供了參考資料。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY 超高效液相色譜儀 和 Xevo TQ MS質(zhì)譜儀（美國Waters公司）； 固相萃取儀（美國Supelco公司）； YP402N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）； R201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申勝生物技術(shù)有限公司）； 循環(huán)水式多用真空泵（杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司）； HH4 恒溫水浴鍋和SHZ82型氣浴恒溫振蕩器（江蘇金壇億通電子有限公司）。

乙腈和甲醇（色譜純，美國Fisher公司）； 甲酸（色譜純，Roe Scientific公司）； 純凈水（娃哈哈公司）； C18小柱（500 mg/6 mL，艾杰爾公司）； HLB固相萃取小柱（60 mg，美國Waters公司）； 酸性氧化鋁（75～150 μm，層析用，上海五四化學試劑廠）； 玻璃層析柱（25 cm×0.1 cm）。99.9%的溴嘧氯草醚標準品和原藥均由中國科學院上海有機化學研究所提供。其它試劑均為分析純。

土壤A/B/C分別采自浙江金華、浙江余杭和浙江蕭山地區(qū)的3種有代表性且不同性質(zhì)的土壤，沉積物和水采自浙江西湖代表性水域。

2.2 標準溶液配制及原藥溶液配制

準確稱取適量標樣，用乙腈配制藥物標準儲備液，4℃保存。將標準儲備液稀釋成0.0005、0.001、0.002、0.005、0.01和0.02 mg/L系列標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

準確稱取適量原藥，用乙腈定容，配制1000 mg/L溴嘧氯草醚原藥母液。

2.3 樣品提取與凈化

2.3.1 提取 沉積物（土壤）：稱取20 g樣品至三角瓶中，加入5 mL 水和40 mL乙腈，振蕩30 min，抽濾，轉(zhuǎn)出濾液至裝有10 g NaCl的具塞量筒，在濾渣中再加入40 mL乙腈，振蕩30 min，抽濾，合并濾液，劇烈振搖具塞量筒2 min后靜置2 h，吸取10 mL乙腈于40℃濃縮至近干，待過柱。水樣則直接轉(zhuǎn)移過柱。

2.3.2 凈化 用甲醇5 mL、水5 mL預淋固相萃取柱，用20%乙腈5.0 mL溶解殘渣上樣（或直接移取2 mL水樣過柱），再用乙腈水（50%， V/V） 3 mL淋洗小柱并棄去，最后用5.0 mL 乙腈洗脫并收集， 過0.22 μm膜， 待進樣。

2.4 土壤降解實驗

2.4.1 土壤樣品預處理 選取不同類型的土壤研究溴嘧氯草醚的土壤降解特性，3種不同土壤性質(zhì)見表1。稱取20 g土壤（精確至0.01 g）置于250 mL培養(yǎng)瓶中，每種土壤各稱取多份，加水至土壤的40%飽和持水量，塞上有砂芯透氣的硅膠塞預培養(yǎng)2周。

2.4.2 土壤加藥 加藥前先補水至土壤的40%飽和持水量，再在每個培養(yǎng)瓶中加入0.02 mL 1000 mg/L溴嘧氯草醚母液，混勻土壤樣品，溴嘧氯草醚在土壤中的初始理論濃度為1.0 mg/kg。

2.4.3 土壤培養(yǎng) （1）好氧培養(yǎng) 每個培養(yǎng)瓶加藥后，加水至60%飽和持水量混勻，塞上透氣的硅膠塞，置于（25±1）℃黑暗的恒溫箱中培養(yǎng)。（2）厭氧培養(yǎng)每個培養(yǎng)瓶加藥后，加水至土壤表面有1 cm水層，塞上透氣的硅膠塞，置于（25±1）℃黑暗的恒溫箱中培養(yǎng)。endprint

2.4.4 培養(yǎng)土取樣 （1）土壤A取樣 于培養(yǎng)后的0、0.75、3、4.75、6、7、9、15和34 d取樣，每種土壤每次取出2個培養(yǎng)瓶， 測定土壤中溴嘧氯草醚殘留量。（2）土壤B和土壤C取樣 于培養(yǎng)后的0、10、20、30、40、50、60、72、80、100和120 d取樣，每種土壤每次取出2個培養(yǎng)瓶測定土壤中溴嘧氯草醚殘留量。

2.5 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱： ACQUITY UPLCTM BEH C18 （50 mm ×2.1 mm i.d.， 1.7 μm）。 流動相： 梯度洗脫， A相為乙腈、 B相為0.1%甲酸溶液， 梯度洗脫： 0～1 min， 50%～90% A； 1～3.5 min， 90% A； 3.5～4.0 min， 50% A； 4～5 min， 50% A。 流速： 0.2 mL/min。 柱溫： 40℃。 進樣體積： 2 μL。

質(zhì)譜儀器條件： 毛細管電壓為3.0 kV（ESI+）、脫溶劑溫度為400℃、脫溶劑氣流速為800 L/h。一級錐孔電壓為22 V， 溴嘧氯草醚的定性與定量（*）離子對分別為m/z 451.9/281， m/z 451.9/279（*）、碰撞能量均為20 eV。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化

實驗選擇C18色譜柱、乙腈和0.1%甲酸為流動相，采用了梯度洗脫程序，首先采用ESI+的全掃描模式對溴嘧氯草醚進行分子離子峰的確認。由于溴嘧氯草醚含有1個氯原子和1個溴原子，利用熱電公司Xalibur軟件計算溴嘧氯草醚（C19H17O3 N3ClBr）的理論質(zhì)荷比（m/z）分別為：451（100%）、449（75.7%）、453（26.4%）、452（21.7%）、450（16.6%）、454（5.5%）。ESI+的全掃描模式發(fā)現(xiàn)溴嘧氯草醚的同位素峰很明顯，分子離子峰（[M+H]+）分別可見m/z 452、450、454、453、451和455（見圖2）。

的全掃描模式未發(fā)現(xiàn)溴嘧氯草醚明顯分子離子峰，故確定掃描模式為ESI+，分子離子峰為m/z 452，再通過子離子掃描模式確定了溴嘧氯草醚的兩個主要子離子，分別為m/z 279和281。逐步優(yōu)化毛細管電壓、錐孔電壓和碰撞能量等參數(shù)，獲得了測定溴嘧氯草醚的最佳質(zhì)譜條件。

實驗表明，溴嘧氯草醚在C18色譜柱上保留較強，無需使用特殊色譜柱進行分析，而且在流動相的水相添加0.1%甲酸時溴嘧氯草醚響應值較高，含鹽流動相對其響應值并未明顯增加，采用梯度洗脫能獲得更好的峰響應和峰型，故在實驗中采用了乙腈和0.1%甲酸作為流動相的梯度洗脫程序。

3.2 凈化方法的確定

考察了藥物在C18固相萃取小柱和酸性氧化鋁柱上的保留情況：（1）考察了在丙酮/石油醚體系和乙腈水體系下酸性氧化鋁柱填料對溴嘧氯草醚的保留情況，結(jié)果表明，在兩種體系下，酸性氧化鋁填料對溴嘧氯草醚保留作用弱，藥物幾乎在上樣步驟全部流出。（2）藥物在艾杰爾公司和Waters公司的C18固相萃取小柱保留均較好，而且回收率為99%～103%，考慮到艾杰爾公司的C18柱一次性上樣體積大于Waters 公司的HLB柱，故在實驗中優(yōu)先采用了艾杰爾的C18固相萃取小柱。

3.3 標準曲線以及基質(zhì)效應

將2.2節(jié)配制的0.0005～0.02 mg/L溴嘧氯草醚系列標準工作溶液按2.5節(jié)的儀器條件進樣，每個濃度重復進樣3次，以濃度峰面積繪制溴嘧氯草醚標準曲線，其回歸方程為 y=5219034.5741x-689.6385（R2=0.9999）。

配制0.0025 mg/L 溴嘧氯草醚溶劑標樣，同時稱取空白土壤、沉積物和水樣，按照前處理步驟提取凈化，并對空白樣品進樣分析，確定其不含痕量該類藥物后再用空白樣品液配制同溶劑標樣濃度的基質(zhì)標樣，用基質(zhì)標樣的峰面積除以溶劑標樣的峰面積得到的比值r評價基質(zhì)效應，同時也考察了基質(zhì)標樣稀釋10倍后的消除基質(zhì)效應的效果。由圖3可見，

不同環(huán)境樣品基質(zhì)對溴嘧氯草醚的儀器響應影響有差異：（1）土壤B、土壤C、水基質(zhì)對溴嘧氯草醚均有基質(zhì)增強效應，其中，土壤C基質(zhì)對基質(zhì)增強效應最明顯，r=1.761； （2）沉積物基質(zhì)對溴嘧氯草醚有基質(zhì)抑制作用，r=0.880。（3）土壤A對溴嘧氯草醚的基質(zhì)效應不明顯，r=0.982。有明顯基質(zhì)抑制和基質(zhì)增強效應的基質(zhì)標樣稀釋10倍后，基質(zhì)效應基本可以消除。

3.4 方法的檢出限、準確度和精確度

根據(jù)空白樣品的3倍信噪比確定方法的檢出限，10倍信噪比確定方法的定量限，溴嘧氯草醚的檢出限為0.055 μg/kg或μg/L； 定量限為0.2 μg/kg或μg/L。

在空白土壤、沉積物和水樣中進行了0.005、0.05和2.0 mg/kg添加回收實驗，每檔濃度重復5次，按前處理方法提取、凈化。結(jié)果見表2， 土壤中溴嘧氯草醚的平均回收率為89%～106%，相對標準偏差（RSD）為3.0%～8.0%； 沉積物溴嘧氯草醚的平均回收率為93%～102%，RSD為2.8%～4.9%； 水中溴嘧氯草醚的平均回收率為87%～99%， RSD為3.1%～6.7%，詳見表2。 本方法滿足土壤、沉積物和水樣中溴嘧氯草醚殘留分析要求，為環(huán)境中該類藥物檢測提供了參考方法。土壤、沉積物和水樣的添加回收譜圖見圖4（A～K）。

3.5 溴嘧氯草醚土壤降解特性研究

考察了溴嘧氯草醚在3種不同類型的土壤中的降解特性，樣品測定色譜圖見圖4（L～N）， 實驗結(jié)果和降解曲線見圖5。溴嘧氯草醚在土壤A中降解最快，好氧和厭氧半衰期分別為1.72和2.93 d； 溴嘧氯草醚在土壤B中好氧和厭氧半衰期分別為18.1 和24.2 d； 溴嘧氯草醚在土壤C中好氧和厭氧半衰期分別為28.2 和31.4 d。溴嘧氯草醚在3種土壤樣品中降解速度快慢依次為：土壤A>土壤B>土壤C，而且溴嘧氯草醚在土壤A降解速度遠快于土壤B和土壤C。這可能與土壤的pH值、陽離子交換量和土壤質(zhì)地有關(guān)，土壤酸性越強、陽離子交換量越大，溴嘧氯草醚降解越快。在3種土壤中，同種土壤比較，好氧條件下的降解速度快于厭氧條件下的降解速度， 這可能是因為在好氧條件下更能促進好氧微生物生長，與厭氧微生物相比，好氧微生物更能促進溴嘧氯草醚的降解。

4 結(jié) 論

本研究建立了環(huán)境樣品中溴嘧氯草醚的檢測方法，研究了溴嘧氯草醚在3不同性質(zhì)土壤的降解特性，并采用建立的檢測方法檢測了土壤降解樣品，結(jié)果表明， 本方法實用、準確， 溴嘧氯草醚在同一種土壤中的降解速率，好氧條件的降解速度快于厭氧條件， 溴嘧氯草醚在不同性質(zhì)土壤中降解速率差異較大，其降解的快慢可能與土壤的pH值、陽離子交換量和土壤質(zhì)地有關(guān)。endprint