基于離心式富集裝置的酪氨酸磷酸肽分析新方法

孫婕+張萬(wàn)軍+時(shí)照梅+秦偉捷 錢小紅

摘 要 酪氨酸磷酸化及其相應(yīng)激酶活性的研究在抗腫瘤藥物靶點(diǎn)的研發(fā)中具有重要意義。由于酪氨酸磷酸化僅占蛋白質(zhì)總磷酸化含量的不足0.1%，因此規(guī)?；睦野彼崃姿峄b定面臨著重大技術(shù)挑戰(zhàn)。本研究構(gòu)建了TiO2串聯(lián)C18反相填料的離心式富集裝置，結(jié)合抗體免疫沉淀法，建立了酪氨酸磷酸肽的富集策略。此新型富集裝置由吸頭、適配器和離心（EP）管組成，將TiO2富集磷酸肽和C18填料反相分離磷酸肽有機(jī)結(jié)合，以離心的方式進(jìn)行樣品的上樣、清洗、洗脫和分離，再通過(guò)抗酪氨酸磷酸化抗體進(jìn)一步特異性富集酪氨酸磷酸肽，從而實(shí)現(xiàn)了酪氨酸磷酸肽的高效富集和大規(guī)模質(zhì)譜鑒定。通過(guò)離心式富集裝置簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，減少了樣品損失和人為因素干擾； 而且離心式、平行化的樣品處理方式可顯著提高分析通量。將此策略成功用于小鼠肝臟蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化肽段的富集和質(zhì)譜鑒定，在5 mg鼠肝蛋白中共鑒定出967個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)545個(gè)蛋白質(zhì)，顯示了其在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用潛力。

1 引 言

激酶調(diào)控的蛋白質(zhì)磷酸化修飾是最常見(jiàn)、最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，幾乎參與調(diào)節(jié)生命活動(dòng)的所有過(guò)程，包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)活動(dòng)和新陳代謝等[1～3]。其中，蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化及相應(yīng)激酶（Protein tyrosine kinase，PTK）是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵因子，在細(xì)胞增殖、血管生成、細(xì)胞遷移、基因轉(zhuǎn)錄和代謝反應(yīng)等調(diào)節(jié)機(jī)制中均發(fā)揮著重要作用[4]。PTK的活性異常會(huì)擾亂其下游的酪氨酸磷酸化修飾和相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而引起細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)紊亂，最終導(dǎo)致腫瘤形成[5]。已有研究表明，酪氨酸激酶的過(guò)度激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后均密切相關(guān)[6，7]。因此，以酪氨酸激酶為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物研發(fā)是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。迄今為止，美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的28種小分子激酶抑制劑靶向藥物中，超過(guò)80%為酪氨酸激酶抑制劑[8]。因此，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的規(guī)模化研究，獲得其對(duì)應(yīng)激酶活性和相關(guān)信號(hào)通路的信息，對(duì)于抗腫瘤藥物的研發(fā)與臨床應(yīng)用具有重要意義。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的規(guī)模化鑒定也日臻成熟。但蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的質(zhì)譜分析依然面臨巨大挑戰(zhàn)。在生物體內(nèi)，酪氨酸磷酸化修飾含量極低（在磷酸化修飾中，S/T/Y的比例為1800∶200∶1[9]）。質(zhì)譜鑒定時(shí)，大量非酪氨酸磷酸化肽段會(huì)對(duì)酪氨酸磷酸肽的信號(hào)造成干擾和抑制。因此，在分析復(fù)雜樣本時(shí)，對(duì)酪氨酸磷酸肽進(jìn)行選擇性富集是質(zhì)譜鑒定前樣本處理的關(guān)鍵步驟。目前，應(yīng)用于酪氨酸磷酸化修飾肽段的富集方法主要有免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）[10～13]、固相金屬離子親和色譜（Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC）[14，15]和金屬氧化物親和色譜（Metal oxide affinity chromatography，MOAC）[16～18]等。其中最常用的是抗體免疫沉淀富集。但實(shí)際樣本高度的復(fù)雜性和抗酪氨酸磷酸化抗體有限的親和力嚴(yán)重限制了富集的選擇性和鑒定規(guī)模。MOAC常應(yīng)用于磷酸肽的富集鑒定。其中，二氧化鈦（TiO2）法因其操作簡(jiǎn)便、富集效果好、成本低，應(yīng)用最為廣泛。然而，該方法依然存在一些亟待解決的問(wèn)題： 所需樣品起始量大、實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣、極為費(fèi)時(shí)費(fèi)力、結(jié)果重現(xiàn)性較低、對(duì)酪氨酸磷酸肽無(wú)針對(duì)性富集、鑒定規(guī)模有限等。

針對(duì)上述問(wèn)題，本研究構(gòu)建了TiO2串聯(lián)反相填料的離心式富集裝置，結(jié)合抗體免疫沉淀，建立了蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸肽的富集策略。此策略首先通過(guò)新型富集裝置將磷酸肽從復(fù)雜樣品中富集出來(lái)，并將富集產(chǎn)物分離為不同餾分，大幅降低體系的復(fù)雜程度； 再通過(guò)抗體進(jìn)一步特異性富集酪氨酸磷酸肽，從而實(shí)現(xiàn)酪氨酸磷酸肽的大規(guī)模質(zhì)譜鑒定。不同于常規(guī)的磷酸肽富集方法，此新型富集裝置通過(guò)自制的TiO2和反相填料裝填小柱將磷酸肽的富集和反相分離有機(jī)結(jié)合，并以離心方式進(jìn)行樣品的上樣、清洗、洗脫和分離， 不僅精簡(jiǎn)了實(shí)驗(yàn)步驟，減少了樣品損失，而且降低了實(shí)驗(yàn)的勞動(dòng)強(qiáng)度和人為因素干擾，非常適用于大規(guī)模、微量臨床樣品的酪氨酸磷酸肽分析。將此策略應(yīng)用于小鼠肝臟蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化規(guī)?；芯?，共計(jì)富集鑒定酪氨酸磷酸肽849個(gè)，對(duì)應(yīng)967個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)和545個(gè)蛋白，為蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的生理功能研究和癌癥治療靶點(diǎn)篩選提供了技術(shù)支持。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Orbitrap Fusion MS四極桿靜電場(chǎng)軌道阱線性離子阱三合一組合式質(zhì)譜、EasynLC 1000液相色譜、FRESCO 21高速離心機(jī)、RVT5105真空冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）； BP211d分析天平（德國(guó)Sartorius公司）； SBH200D金屬浴加熱儀（英國(guó)Stuart公司）； JY92Ⅱ超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）； 純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

cOmpleteTablets蛋白酶抑制劑、PhosSTOP磷酸酶抑制劑（純度99.9%， 德國(guó)Roche公司）； 測(cè)序級(jí)胰蛋白酶（Trypsin，純度99.9%）、1，4二硫蘇糖醇（DTT，純度99%）及碘乙酰胺（IAA，純度98%， 美國(guó)Promega公司）； 尿素（純度99.0%）、色譜純乙腈（ACN，純度99.9%）、氨水（濃度61.7%， 美國(guó)SigmaAldrich公司）； 三氟乙酸（TFA，純度99%，比利時(shí)Acros公司）； N2羥乙基哌嗪N2乙磺酸（HEPES，純度99%，美國(guó)Amresco公司）； 二氧化鈦顆粒（日本GL Sciences公司）； C8、C18膜（美國(guó)3M公司）； C18反相填料（粒徑3 μm，Agela Technologies公司）； PTM703抗酪氨酸磷酸化抗體（杭州景杰生物科技有限公司）； PTyr100抗酪氨酸磷酸化抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）。endprint

2.2 小鼠肝臟蛋白質(zhì)的提取和酶解處理

2.2.1 小鼠肝臟蛋白質(zhì)提取 取10周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠的肝臟于離心管（EP管）中，加入配制好的尿素裂解液（9 mol/L尿素，20 mmol/L HEPES緩沖溶液，加入適量蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），使用高通量組織研磨器破碎組織后， 將樣品置于冰上，使用超聲破碎儀進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，取上清液，備用。

2.2.2 蛋白質(zhì)酶解 取5 mg鼠肝蛋白，用尿素裂解液（9 mol/L 尿素，加入適量蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑）稀釋1倍，在溶液中加入DTT（終濃度4.5 mmol/L），55℃金屬浴孵育30 min。冰上冷卻至室溫后，加入10 mmol/L IAA充分混勻，室溫避光靜置30 min。用20 mmol/L HEPES緩沖液將所得蛋白溶液稀釋4倍后，按胰蛋白酶和蛋白質(zhì)1∶100 （m/m）加入胰蛋白酶，37℃酶解過(guò)夜后，使用SepPak C18柱將產(chǎn)物肽段脫鹽，凍干。

2.3 磷酸肽富集與分離

2.3.1 TiO2填料裝填富集吸頭和C18反相填料裝填分離吸頭的制作 取200 μL移液器吸頭，每只吸頭裝填4 mg TiO2填料和1層C8膜； 取10 μL超長(zhǎng)吸頭，裝填3層C18膜、3 mg C18反相填料； 分別以200 μL乙腈和200 μL 15%氨水平衡富集和分離吸頭。

2.3.2 磷酸肽的富集與分離 使用200 μL Binding 緩沖液（64% ACN+20%乳酸+ 4%TFA，V/V）溶解5 mg肽段，并轉(zhuǎn)移至TiO2富集吸頭中。將TiO2富集吸頭固定在裝有適配器的EP管中，500 g 離心。收集EP管中的流穿液，重復(fù)上樣，共富集3次。采用200 μL Washing 緩沖液（80% ACN+5% TFA，V/V）清洗， 去除非磷酸肽，重復(fù)3次。將TiO2富集吸頭插入C18分離吸頭中，將二者串聯(lián)結(jié)合，并固定于新的帶有適配器的EP管。依次加入梯度洗脫液各200 μL： （1）15%濃氨水，500 g 離心； （2）2% ACN+98%（15%濃氨水），500 g 離心； （3）5% ACN+95%（15% 濃氨水），500 g 離心； （4）8% ACN+92%（15% 濃氨水），500g 離心； （5）10% ACN+90%（15% 濃氨水），500 g 離心； （6）40% ACN+60%（15% 濃氨水），500 g 離心。分別收集梯度洗脫的流穿液，兩兩合并： 2%+8% ACN、5%+10% ACN、0+40% ACN，凍干，

2.4 抗體富集酪氨酸磷酸化肽段 分別取兩種固載抗酪氨酸磷酸化抗體的微球各15 μL，混合置于EP管中。將凍干的磷酸肽溶解于100 μL IP緩沖液（50 mmol/L TrisHCl，50 mmol/L NaCl， pH 6.9）中，與抗體微球混合后于4℃混懸過(guò)夜。之后使用300 μL IP緩沖液，反復(fù)清洗3次， 去除非酪氨酸磷酸肽。加入100 μL 0.15% （V/V） TFA洗脫所富集的酪氨酸磷酸肽，脫鹽凍干后80℃保存。

2.5 質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜條件： 正離子掃描模式； 電噴霧電壓為2.2 kV，一級(jí)質(zhì)譜分辨率為120000，一級(jí)AGC為5.0×105，最大離子注入時(shí)間為50 ms，全掃描質(zhì)荷比范圍為300～1400； 二級(jí)質(zhì)譜母離子的選擇采用數(shù)據(jù)依賴模式，HCD碰撞能量設(shè)定為32%，AGC為1.0e2，最大離子注入時(shí)間為250 ms，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)為18 s，質(zhì)譜采集時(shí)間為78 min。

數(shù)據(jù)檢索條件： 采用Proteome Discoverer 1.4軟件，以Mascot搜索引擎對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索，蛋白酶切類型選擇Trypsin，允許最大肽段漏切位點(diǎn)數(shù)設(shè)為2，一級(jí)搜索質(zhì)量偏差 ≤15 ppm， 二級(jí)搜索質(zhì)量偏差≤0.5 Da，固定修飾為Carbamidomethyl（C），可變修飾為Oxidation（M）、 Acetyl（protein Nterm）、 Phosphorylation（ST）和Phosphorylation（Y）。肽段水平假陽(yáng)性率（FDR）≤1%。

3 結(jié)果與討論

3.1 磷酸化肽段的富集策略

復(fù)雜生物樣本中蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的規(guī)模化鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的難點(diǎn)。常規(guī)的酪氨酸磷酸肽富集鑒定策略通常采用強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜（SCX）將肽段樣品分離為多個(gè)餾分，再對(duì)每個(gè)餾分分別進(jìn)行磷酸肽富集和抗體免疫沉淀，最后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)[19]。這種方法可顯著降低樣本的復(fù)雜性，提高富集效率； 但起始樣本需求量大，步驟繁瑣，且質(zhì)譜檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)。為了解決此問(wèn)題，本研究構(gòu)建了TiO2串聯(lián)反相填料的富集裝置，將磷酸肽的富集和分離有機(jī)結(jié)合，并通過(guò)離心的方式實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)便、快捷、高通量的磷酸肽富集、洗脫和分離。此裝置包括裝填TiO2和C8膜的富集吸頭，裝填C18膜和C18反相填料的分離吸頭，以及裝有適配器的EP管收集器（圖1A）。使用時(shí)，首先將肽段樣品上樣到固定于EP管收集器的富集吸頭中（圖1B），并清洗去除非磷酸肽； 再將富集吸頭與分離吸頭串聯(lián)固定（圖1C），將所富集的磷酸肽洗脫并保留在串聯(lián)的分離吸頭中； 最后采用不同乙腈含量的堿性洗脫液梯度洗脫，分離得到6個(gè)餾分，并交叉合并為3個(gè)餾分，分別進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。此策略將經(jīng)TiO2富集后，

圖1 新型離心式磷酸肽富集與分離裝置圖。A 裝置分解圖； B 富集裝置； C 分離裝置

Fig.1 A new centrifugal device for phosphopeptides enrichment and separation： （A） An assembled view of the device， （B） enrichment device and （C） separation deviceendprint

氨水洗脫的磷酸肽直接串聯(lián)高pH反相分離，從而將磷酸肽的富集與分離有機(jī)結(jié)合。避免了常用的SCX分離中，肽段脫鹽和凍干等一系列繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作步驟和樣本損失。同時(shí)，高pH反相分離與液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)使用的低pH反相分離具有良好的正交性，能夠有效降低富集產(chǎn)物的復(fù)雜程度，提高磷酸肽的質(zhì)譜鑒定效果[20]。采用此裝置，以1 mg鼠肝蛋白為樣品，在一次實(shí)驗(yàn)的3個(gè)餾分中分別鑒定到3269、2918和3217個(gè)磷酸肽（表1）。通過(guò)韋恩圖（圖2A）分析可知，77.7%的磷酸肽只在1個(gè)餾分中被鑒定到，說(shuō)明了此裝置可對(duì)磷酸肽高效富集分離。3個(gè)餾分共鑒定到10793個(gè)磷酸化位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)7333個(gè)非冗余磷酸肽。同樣條件下，未經(jīng)餾分分離而直接進(jìn)行質(zhì)譜鑒定， 只能得到3405個(gè)磷酸肽，富集選擇性為74.0%，說(shuō)明分餾策略可以在保證富集選擇性的前提下顯著提高磷酸肽的鑒定規(guī)模。將分餾后的餾分交叉合并，可將色譜保留行為差異較大的肽段混合，有效提高分餾與后續(xù)液相色譜質(zhì)譜鑒定中色譜分離的正交性，比采用順序合并更能使肽段均勻分布在整個(gè)色譜梯度洗脫的范圍內(nèi)，充分利用質(zhì)譜的掃描時(shí)間，從而達(dá)到縮短質(zhì)譜分析時(shí)間的目的[13，21，22]。使用此裝置，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)分別鑒定到7333、7587和7962個(gè)磷酸化肽段，富集選擇性為71.9%±2.4%。其中50.2%的磷酸肽至少在兩次實(shí)驗(yàn)中被鑒定到（圖2B）。此外，此富集分離裝置與實(shí)驗(yàn)室常用離心機(jī)兼容性良好，通過(guò)離心式操作，可大大減輕實(shí)驗(yàn)者勞動(dòng)強(qiáng)度，并可同時(shí)平行處理高達(dá)24個(gè)樣品，顯著提高了樣品處理的通量。

3.2 小鼠肝臟蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化修飾蛋白質(zhì)組分析

在上述方法學(xué)研究的基礎(chǔ)上，本研究對(duì)復(fù)雜的生物樣本小鼠肝臟的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化修飾蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析。由于生物體內(nèi)酪氨酸磷酸化肽段含量極低，其在TiO2富集產(chǎn)物中仍屬于低豐度肽段，在質(zhì)譜鑒定時(shí)易受到其它非酪氨酸磷酸肽的抑制，鑒定比例通常不超過(guò)總磷酸肽數(shù)量的1%。因此， 本研究對(duì)通過(guò)新型富集裝置所得的總磷酸肽使用抗酪氨酸磷酸化抗體進(jìn)行進(jìn)一步的針對(duì)性富集，完整實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖3。采用此新型富集分離策略，以5 mg鼠肝蛋白為樣品，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)分別鑒定到482，429和564個(gè)酪氨酸磷酸肽，合計(jì)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)達(dá)到967個(gè)，對(duì)應(yīng)545個(gè)蛋白質(zhì)。本研究同樣以5 mg鼠肝蛋白為樣品，單純使用抗酪氨酸磷酸化抗體富集，經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到酪氨酸磷酸化位點(diǎn)127個(gè)，對(duì)應(yīng)106個(gè)蛋白質(zhì)。與單純使用抗酪氨酸磷酸化抗體富集的鑒定結(jié)果相比，修飾位點(diǎn)和蛋白質(zhì)鑒定規(guī)模分別提高6倍和4倍。上述結(jié)果表明，此分析策略對(duì)于微量樣本中蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化富集鑒定的高效性。采用生物信息學(xué)工具DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)鑒定到的545個(gè)酪氨酸磷酸化蛋白進(jìn)行了GO注釋分析[23]。通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析可知，鑒定到的蛋白主要集中在外泌體、細(xì)胞液和細(xì)胞質(zhì)中（圖4A）。對(duì)蛋白質(zhì)參與的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，鑒定到的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)主要參與細(xì)胞的代謝過(guò)程、氧化還原過(guò)程和磷酸化過(guò)程（圖4B）。蛋白分子功能則主要包括細(xì)胞粘附、氧化還原和催化等（圖4C）。上述分析與文獻(xiàn)[4，5]報(bào)道的酪氨酸磷酸化蛋白的主要功能相符，驗(yàn)證了鑒定結(jié)果的可靠性。

4 結(jié) 論

本研究建立了一種可用于復(fù)雜樣本中酪氨酸磷酸化修飾蛋白質(zhì)的規(guī)模化鑒定的富集新策略。通過(guò)TiO2串聯(lián)反相填料的新型離心式富集裝置，將磷酸肽的富集和分離有機(jī)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)便、快捷、平行化的磷酸肽富集和分離。在此基礎(chǔ)上，采用抗酪氨酸磷酸化抗體對(duì)酪氨酸磷酸化肽段進(jìn)行進(jìn)一步針對(duì)性富集，結(jié)合質(zhì)譜鑒定，成功實(shí)現(xiàn)了小鼠肝臟的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究建立的技術(shù)策略在翻譯后修飾蛋白質(zhì)組的高通量富集與鑒定研究中具有良好的應(yīng)用潛力。endprint