基于石墨烯信號放大策略的膽固醇分子印跡電化學(xué)傳感器研究

白慧萍+王春瓊+曹秋娥

摘 要 利用石墨烯的信號放大作用，結(jié)合分子印跡技術(shù)和電聚合技術(shù)，以苯酚為功能單體，膽固醇（ChO）為模板分子，在石墨烯修飾的玻碳電極表面電聚合能識別膽固醇分子的敏感膜，構(gòu)建膽固醇分子印跡電化學(xué)傳感器。采用掃描電鏡、循環(huán)伏安法、差分脈沖伏安法研究了印跡膜的結(jié)構(gòu)、性能和分子印跡效應(yīng)。結(jié)果表明，此傳感器對膽固醇有良好的選擇性和較高的靈敏度。膽固醇濃度在8.0×108 mol/L。將其用于人體血清樣品的檢測，結(jié)果滿意。

1 引 言

膽固醇（Cholesterol， ChO）也稱膽甾醇，是多種疾病診斷的重要生物指標[1]。血清中高膽固醇的存在是引發(fā)多種疾?。ㄈ绻谛牟?、心肌梗塞、動脈硬化高血壓等）的主要因素，而膽固醇低也可能會導(dǎo)致低脂蛋白血癥、貧血、敗血癥、營養(yǎng)不良、甲亢和肝病[2]。因此，準確、靈敏、快速地監(jiān)測膽固醇水平對臨床分析和診斷非常重要。常用的膽固醇檢測方法有光譜法[3，4]、比色法[5，6]、高效液相色譜法[7，8]、高效液相色譜質(zhì)譜法[9]和電化學(xué)法[10，11]。其中，電化學(xué)生物傳感器由于具有高靈敏度、高選擇性和實時檢測等優(yōu)點，在膽固醇的檢測中被廣泛應(yīng)用。目前關(guān)于膽固醇電化學(xué)生物傳感器的研究更多地集中于電極和固定化膽固醇氧化酶之間的電子轉(zhuǎn)移[12，13]。然而在電極表面固定化酶是有局限性的，因為在固定化過程中酶很容易變性，而且，空間位阻效應(yīng)和支撐材料的存在也會影響酶的活性。此外，酶的固定化過程成本高，酶的活性還常常受到pH值、溫度、濕度和有毒化學(xué)物的影響[14]。這些因素都將制約基于酶修飾的傳感器的進一步發(fā)展。與生物傳感器相比，以分子印跡聚合物作為傳感介質(zhì)修飾得到的分子印跡電化學(xué)傳感器在保持高選擇性和高靈敏度的同時，具有制備簡單、成本低、使用條件受pH值和溫度等影響小的優(yōu)點，并能實現(xiàn)一些原來不能或者需要前處理之后才能測定的樣品的直接測定[15，16]。近年的研究表明，許多新型功能納米材料，如石墨烯、碳納米管、量子點、金屬納米顆粒等的引入不僅可以克服印跡聚合物的缺陷，而且可以顯著提高傳感器的靈敏度和選擇性[17]。本研究以膽固醇為研究對象，針對生物樣品的復(fù)雜性和現(xiàn)場檢測所需的快速性，利用石墨烯信號放大策略，采用循環(huán)伏安法將分子印跡膜聚合在石墨烯修飾的玻碳電極表面，獲得膽固醇分子印跡電化學(xué)傳感器?；诓钍久}沖伏安法，建立了測定膽固醇的電化學(xué)分析方法，實現(xiàn)了人血清中膽固醇的快速靈敏測定。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CHI660D電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）； 797伏安極譜儀（瑞士萬通公司）； Agilent 1200高效液相色譜儀、ZORBAXC18柱（250 mm × 4.6 mm， 5 μm）（美國Agilent公司）； TG16WS離心機（常州高科儀器公司）。

苯酚、抗壞血酸（天津光復(fù)化工研究院）； 石墨粉（2～15 μm，99.9995%）、尿酸（UA）、膽固醇（ChO）和血清白蛋白（ALB），均購自美國Alpha公司，上述試劑均直接使用。實驗室用水為18.25 MΩ·cm的超純水。

2.2 石墨烯及修飾電極的制備

實驗采用改進的Hummer和Offerman法制備氧化石墨烯[18]。將1 g石墨粉與50 g NaCl混合研磨，用水溶解，過濾。取上層固狀石墨加入23 mL濃H2SO4中，室溫下攪拌12 h。冰浴中緩慢加入6 g KMnO4后，于105℃攪拌4 h至溶液顏色呈棕黃色，加入100 mL超純水和10 mL 30% H2O2繼續(xù)反應(yīng)2 h。向反應(yīng)物中加入150 mL超純水，裝入透析帶，用5% HCl和水洗至pH中性。將所得氧化石墨用水分散后超聲8 h，靜置過夜，取上層液離心分離，40℃真空干燥，得到氧化石墨烯（GO）。取50 mg氧化石墨烯，加入20 mL水混合后，再加入0.5 mL肼。超聲處理1 h后，50℃攪拌24 h，過濾，真空干燥得到石墨烯（RGO）。

將石墨烯分散于超純水，超聲1 h得到均一的懸浮液（1 mg/mL）。取10 μL懸浮液滴涂于預(yù)處理好的電極表面，置于紅外燈下15 min，得到石墨烯修飾電極（RGO/GCE）。

2.3 分子印跡膜和非印跡膜修飾電極的制備

將RGO/GCE置于含0.016 mol/L苯酚、1.0 mmol/L ChO的硼砂緩沖溶液（0.05 mol/L硼砂+0.2 mol/L NaOH，pH 9.2）中，在0.2～0.8 V范圍內(nèi)進行電聚合，掃速50 mV/s，掃描40圈，得到苯酚聚合膜修飾電極。電聚合液在使用前通氮氣15 min。取出電極，用超純水沖洗吸附不緊密的分子后，置于無水乙醇中洗脫15 min，去除模板分子，制得分子印跡膜修飾電極（MIP/RGO/GCE）。非印跡傳感器（NIM/RGO/GCE）的制備除不加ChO外，其余步驟與印跡傳感器的制備完全相同。

2.4 電化學(xué)檢測

將三電極系統(tǒng)放入待測溶液（以5.0 mmol/L K3Fe（CN）6為探針，0.1 mol/L KCl為支持電解質(zhì)）中，待背景電流穩(wěn)定后，進行循環(huán)伏安（CV）和差示脈沖（DPV）的測定。其中，CV測定條件：掃描范圍為 0.2～0.6 V，掃描速率為100 mV/s；DPV測定條件：掃描范圍和速率同CV，電位增量為0.004 V，振幅為0.05 V，脈沖寬度為0.05 s，采樣寬度為0.016 s。

裸玻碳電極直接進行測定；印跡和非印跡傳感器先在被測液中孵化5 min后再進行測定，測定結(jié)束后，置于10 mL乙醇溶液中，攪拌洗脫5 min后取出，于4℃保存待用。

3 結(jié)果與討論

3.1 分子印跡聚合膜的伏安行為

苯酚及其衍生物被常用于制備絕緣聚合物薄膜。本研究以苯酚為電聚合功能單體，膽固醇為模板分子，在0.05 mol/L硼砂溶液（pH 9.2）中采用循環(huán)伏安電聚合法制備分子印跡電化學(xué)傳感器。endprint

圖1A為石墨烯修飾電極在掃速為50 mV/s下得到的循環(huán)伏安圖。由圖1A可知，掃描第一圈時的陽極峰電位為0.62 V，陽極峰電流為280 μA，隨著掃描圈數(shù)的增加，峰電流越來越小，峰電位負移，直至消失。表明隨著電沉積過程的進行，印跡聚苯酚膜不斷覆蓋到電極表面，其絕緣性導(dǎo)致電流逐漸減少。圖1B為裸玻碳電極的電聚合圖，比較圖1A和1B可知，石墨烯的引入，增加了電極的電子傳遞能力和比表面積，從而使峰電流增強，回路明顯變寬。因此，與裸玻碳電極相比，修飾了石墨烯納米材料的電極需要更多的掃描次數(shù)，才可以使電極表面完全被不導(dǎo)電的印跡聚合膜所覆蓋。

3.2 分子印跡膜的形貌表征

采用掃描電鏡對不同修飾電極的形貌進行了表征。由圖2可見，修飾在電極表面的石墨烯（A）呈現(xiàn)二維空間結(jié)構(gòu)，其形貌似褶皺的薄紗；當(dāng)在石墨烯表面電聚合分子印跡膜后（B），褶皺明顯減少，表面相對平整，說明石墨烯表面被印跡膜所覆蓋；分子印跡膜經(jīng)洗脫去除模板分子后（C），表面由平滑變得粗糙，產(chǎn)生大量的印跡聚合物納米顆粒。表面粗糙度的增加和納米顆粒的生成增大了印跡聚合膜的比表面積，增強了電極對印跡分子的吸附量，從而有利于提高傳感器的靈敏度和選擇性。經(jīng)過洗脫后的非印跡膜（D）表面仍以石墨烯的層狀結(jié)構(gòu)為主，未出現(xiàn)大量的印跡聚合物納米顆粒。

0.2～0.6 V）內(nèi)，膽固醇沒有電活性。 考察了不同修飾電極在含有5.0 mmol/L K3Fe（CN）6和0.1 mol/L KCl的緩沖溶液（pH 6.0）中的循環(huán)伏安行為（圖3）。由圖3A可見，裸玻碳電極上有一對明顯的氧化還原峰（a）。修飾石墨烯后，電極的氧化還原峰電流顯著增大，達到100 μA（b），說明石墨烯的存在增加了電極的導(dǎo)電性能。石墨烯被印跡聚合膜覆蓋后，電極上的氧化還原峰消失（c），表明電極表面完全被致密的不導(dǎo)電印跡膜覆蓋，這層膜阻礙了K3Fe（CN）6探針在電極表面的氧化還原反應(yīng)。當(dāng)印跡膜中的模板分子ChO被洗脫后，電極上的再次出現(xiàn)氧化還原峰（d），說明洗脫后的膜中形成了印跡孔穴，因此電子可以到達傳感器。當(dāng)印跡孔穴再次結(jié)合模板分子后，膜中的傳質(zhì)通道被堵塞，導(dǎo)致電極上的峰電流降低（e）。對于非印跡傳感器（圖3B），由于洗脫前后的膜中都不存在可供離子傳遞的通道，因此都無電流響應(yīng)。

3.4 印跡電極制備及應(yīng)用條件優(yōu)化

3.4.1 電聚合掃描圈數(shù)的優(yōu)化 電聚合過程中不同掃描圈數(shù)（20、30、40、50、60）對電極響應(yīng)性能的影響如圖4所示。

6 mol/L cholesterol （ChO） in 0.1 mol/L KCl containing 5.0 mmol/L K3Fe（CN）6. The error bars represent the standard deviation of results for n=2.5當(dāng)掃描圈數(shù)達到40圈時，傳感器對模板分子的響應(yīng)電流值ΔI（ΔI=I0-Ic， I0為不含ChO時的峰電流，Ic為測定體系中加入ChO后DPV的峰電流）達到了最大；此后，隨著掃描圈數(shù)增加，響應(yīng)電流反而下降。原因可能是，當(dāng)印跡聚合膜太厚時，位于聚合膜內(nèi)部的模板分子不能被完全洗脫[19]，從而降低了電極的響應(yīng)靈敏度。因此，本實驗選擇電聚合掃描圈數(shù)為40。

3.4.2 單體用量的優(yōu)化

聚合過程中加入的模板與單體的比例對傳感器的性能至關(guān)重要，實驗在固定聚合體系中模板分子的濃度為1.0 mmol/L的條件下，改變模板與功能單體的摩爾比（1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、 1∶24），研究了功能單體用量對制備的印跡傳感器的影響（圖5）。結(jié)果表明，隨著功能單體用量的增加，傳感器對5.0×10mol/L ChO的電流響應(yīng)值先增加后減少，模板與功能單體的摩爾比達到 1∶16時有最大值。因此，本實驗選擇模板與功能單體的加入摩爾比為1∶16。

3.4.3 洗脫時間的優(yōu)化 為了獲得令人滿意的靈敏度和選擇性，完全洗脫印跡膜中的模板分子是非常重要的?？紤]到膽固醇較易溶于乙醇，本實驗選擇乙醇來去除印跡膜中的模板。 采用DPV記錄不同洗脫時間后的傳感器在緩沖溶液中的峰電流變化， 結(jié)果表明，隨洗脫時間延長，峰電流先增加，在洗脫時間達到10 min后逐漸趨于穩(wěn)定。為了獲得最高的印跡效率和檢測靈敏度，選擇洗脫時間為15 min。

3.4.4 測定過程中平衡時間的優(yōu)化 將洗脫好的修飾電極浸泡在5.0×10mol/L ChO溶液中孵化1、3、5、10和15 min，然后置于緩沖溶液中進行DPV掃描，記錄相應(yīng)峰電流值。結(jié)果表明，隨著孵化時間延長，峰電流不斷下降，5 min后，峰電流達到最小值并趨于平穩(wěn)，說明此時電極對膽固醇的吸附基本趨于飽和。因此，本實驗的平衡時間選擇5 min。

3.5 MIM/RGO/GCE的線性范圍與檢出限

為探討MIM/RGO/GCE的實用性，采用差示脈沖法DPV繪制了此傳感器測定膽固醇的工作曲線。mol/L。此傳感器測定ChO的校正曲線是由兩部分組成，說明在傳感器的印跡膜中存在兩類結(jié)合位點，即對ChO有高親和力和低親和力的結(jié)合位點，這是非共價印跡聚合物/膜對模板分子產(chǎn)生吸附的普遍特性[20]。

采用相同的聚合方法和條件在裸玻碳電極表面制備了ChO印跡膜電極（MIM/GCE），并研究了此電極測定ChO的線性范圍和檢出限。響應(yīng)電流 4 mol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為ΔI=2.676+0.425C （μmol/L） （r=0.9969）和ΔI=4.012+0.238C （μmol/L） （r=0.9987）。檢出限（S/N=3）為8.0×107 mol/L?？梢?，MIM/RGO/GCE的檢出限遠低于MIM/GCE，表明石墨烯的引入顯著增加了傳感器的靈敏度。與其它測定ChO的文獻方法相比（表1）， 此MIM/RGO/GCE傳感器測定膽固醇具有相對較低的檢出限、高的靈敏度和令人滿意的線性范圍。

3.6 電極的選擇性、重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

實驗測定了傳感器在緩沖溶液中對5.0 μmol/L ChO的DPV響應(yīng)，以及含有可能會對人血清中ChO測定產(chǎn)生影響的血清白蛋白（ALB）、尿酸（UA）、葡萄糖（Glc）和抗壞血酸（Vc）時的DPV響應(yīng)。由圖7可見，10倍濃度于ChO的ALB、UA、Glc和Vc并沒有明顯干擾到ChO的測定結(jié)果，表明印跡膜的結(jié)合位點能夠有效地選擇膽固醇，可能的干擾物并不會對膽固醇的測定產(chǎn)生影響。

用同一支電極平行測定5.0 μmol/L ChO 5次，相對標準偏差RSD=2.4%；用相同方法制備的5支電極對相同濃度的ChO進行測定，RSD=3.0%； 電極于4℃保存，2周后測定ChO的響應(yīng)值基本沒有變化，使用60次后響應(yīng)值降至初始響應(yīng)值的89%左右，表明此電極具有較長的使用壽命和良好的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性。

3.7 實際樣品分析

將制備的傳感器用于人血清（云南大學(xué)校醫(yī)院提供，3000 r/min離心15 min，取10 μL上清液稀釋至10 mL）中ChO的測定。由表2可知，人血清樣品測定結(jié)果的RSD<2.9%，加標回收率在99.8%～102.0%之間，初步說明測定結(jié)果是準確可靠的。為進一步驗證此傳感器的測定結(jié)果，采用高效液相色譜法[8]測定出未經(jīng)稀釋的該人血清樣品中ChO的濃度為4.60 mmol/L（健康人的正常血漿總膽固醇通常不超過5.72 mmol/L）。高效液相色譜的測定結(jié)果與傳感器的檢測結(jié)果基本一致。

4 結(jié) 論

采用膽固醇作為模板分子，石墨烯納米材料為基底，利用電聚合技術(shù)將苯酚印跡聚合膜修飾到玻碳電極表面，制得新型膽固醇印跡電化學(xué)傳感器。結(jié)果表明，石墨烯的引入不僅可以增加電子傳遞速率，且與分子印跡膜結(jié)合后，使印跡材料的比表面積增加，電流響應(yīng)信號增強，提高了傳感器的靈敏度，選擇性好，并成功用于血清樣品中膽固醇的直接檢測。endprint