蟲草素與羥丙基β環(huán)糊精的包合行為及性能研究

趙芳+趙雪秋+常清+王淑慧+杜瑤+楊麗娟

摘 要 通過飽和溶液方法制備了蟲草素（COR）與羥丙基β環(huán)糊精（HPβCD）形成的包合物。采用紫外可見光譜法對(duì)水溶液中HPβCD與蟲草素（COR）的包合行為進(jìn)行研究，利用Job曲線法確定COR/HPβCD包合物的包合比，通過1H NMR和2D NMR、DSC、TG、XRD 、FTIR和SEM對(duì)COR/HPβCD包合物進(jìn)行表征和性能測(cè)定。結(jié)果表明，COR/HP βCD包合物的包合比為1∶1，蟲草素與HPβCD形成包合物后，其水溶性、熱穩(wěn)定性及生物環(huán)境穩(wěn)定性都得到明顯提高。COR/HPβCD包合物在醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。

1 引 言

蟲草素（Cordycepin，COR，C10H13N5O3，結(jié)構(gòu)如圖1），又稱蟲草菌素、3脫氧腺苷，屬于嘌呤類生物堿，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥冬蟲夏草的有效成分。蟲草素最初從野生真菌中分離出來，是第一種天然核苷類抗菌素[1，2]。研究表明，蟲草素具有抗腫瘤、抗真菌、抑制微生物生長(zhǎng)、抗炎、降血糖、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種藥用功效[3～6]。特別是對(duì)于白血病的治療[7，8]，具有良好的臨床應(yīng)用前景。但是野生冬蟲夏草的資源有限[9]，并且其藥用有效成分蟲草素的含量低，水溶性和生物利用度也低[9～11]，在體內(nèi)不穩(wěn)定、容易降解而失去活性[12]，導(dǎo)致其在藥物制劑方面的應(yīng)用受到限制[13]。目前，主要通過結(jié)構(gòu)修飾[14～16]，或者與腺苷脫氨酶抑制劑聯(lián)合應(yīng)用[17，18]來改善蟲草素的穩(wěn)定性。但這些方法存在著制備困難[14]、選擇性抑制大部分病毒[16]以及容易產(chǎn)生副作用[17]等問題。因此，研究有效的藥物輔料以提高蟲草素的穩(wěn)定性、水溶性和生物利用度具有重要意義。

圖1 蟲草素（COR）的結(jié)構(gòu)

Fig.1 Structure of cordycepin （COR）

環(huán)糊精（Cyclodextrin，CD）及其衍生物作為一種優(yōu)良的脂溶性藥物載體，一直以來都是研究熱點(diǎn)。其中衍生物羥丙基β環(huán)糊精（Hydroxypropylβcyclodextrin，HPβCD）在藥物、食品、化妝品等各個(gè)領(lǐng)域均被廣泛的應(yīng)用[1922]。主要是因?yàn)镠PβCD的空腔大小適中，水溶性較好，在人體內(nèi)的毒副作用小，原料便宜易得，且對(duì)提高藥物溶解度及生物利用度有著顯著的效果[19，23～25]。

在前期研究中，本課題組已成功應(yīng)用環(huán)糊精的包合技術(shù)來改善黃酮類（橙皮素和山姜素）、木脂素類（鬼臼毒素）等天然藥物分子的溶解度和穩(wěn)定性[26～28]。結(jié)果表明，這些天然藥物分子與HPβCD進(jìn)行包合后，溶解度和穩(wěn)定性得到明顯改善。橙皮素、山姜素和鬼臼毒素的溶解度分別提高了411、15和28倍，其中鬼臼毒素本身的細(xì)胞毒活性在包合后沒有受到影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)環(huán)糊精與蟲草素的包合物進(jìn)行了研究。雖然Zhang等[29]報(bào)道了αCD、βCD和γCD 3種環(huán)糊精與蟲草素的包合研究，但HPβCD與蟲草素的包合研究未見報(bào)道。本研究將著重探討HPβCD與蟲草素形成包合物的包合模式、包合物的表征及溶解效應(yīng)，提供一種制備高溶解度和低毒的藥物分子的新途徑。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Aglient 8453紫外可見分光光度計(jì)（美國(guó)Aglient公司）；STA449F3熱重分析儀（德國(guó)耐馳公司）；Bruker Avance DRX500核磁共振儀（瑞士Bruker 公司）；轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀（日本理學(xué)公司TTR 18 kW銅靶）；Nicolet IS10 紅外光譜儀（美國(guó)Thermo科技有限公司）。

COR（純度>98%，寶雞市晨光生物科技有限公司）；HPβCD（FW=1460.00，百靈威科技有限公司）。其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2 COR/HPβCD包合物和物理混合物的制備

按摩爾比1∶1準(zhǔn)確稱取COR 5.0 mg，HPβCD 29.2 mg于50 mL圓底燒瓶，加入10 mL乙醇水混合液（1∶4，V/V），室溫下避光攪拌14天，過濾除去不溶雜質(zhì)，濾液再用0.45 μm微孔膜過濾，于50℃下減壓蒸餾、真空干燥，即得白色固體包合物。

物理混合物則按摩爾比1∶1稱取COR和HPβCD，使其充分混合即得。

2.3 Job曲線測(cè)定

COR/HPβCD包合物的化學(xué)計(jì)量比可以通過Job法[30]確定。采用pH=3.0的Na2HPO4檸檬酸緩沖液配制系列濃度的COR與HPβCD混合液，保持COR和HPβCD的總濃度為4.5×10mol/L，其中COR與HPβCD的摩爾比在0～1內(nèi)變化[31，32]。 在其最大吸收波長(zhǎng)258 nm處測(cè)定吸光度。

2.4 COR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

用無水乙醇分別配制濃度為0.021、0.023、0.025、0.027、0.029、0.031、0.033和0.035 mol/L的COR溶液并測(cè)定其吸光度。然后在Origin 8.5軟件中，以COR溶液的濃度C（mmol/L）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)作圖。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=25.80671C-0.14713，R2=0.99943（n=8）。

2.5 COR/HPβCD包合物的水溶性實(shí)驗(yàn)

通過制備飽和溶液的方法[33]測(cè)定COR/HPβCD包合物在水溶液中的溶解度。將過量的COR/HPβCD包合物投入2 mL水中（pH≈7.0），避光攪拌1 h，過濾后減壓蒸餾得到白色固體。用乙醇稀釋，在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)COR的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算包合物中COR的含量。

2.6 紫外可見光譜滴定實(shí)驗(yàn)

固定COR的濃度為0.02 mmol/L，按表1配制HPβCD的濃度，并分別采用Na2HPO4檸檬酸、NaHCO3無水Na2CO3和Na2HPO4NaH2PO4緩沖體系控制溶液的pH值為3.0、10.5和7.2，用乙醇水混合液（1∶4，V/V）和緩沖溶液定容，測(cè)定紫外可見吸收光譜。endprint

移取一定體積的COR溶液，加入適量環(huán)糊精， 于兩個(gè)25 mL棕色容量瓶中，用乙醇水混合液（1∶4， V/V）和緩沖溶液定容，其中緩沖液為pH=1.5的KClHCl溶液。在37℃恒溫水浴中放置1 h，于最大吸收波長(zhǎng)下，每隔（12±2） h測(cè)定一次吸光度。所有實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次。

3 結(jié)果與討論

3.1 Job曲線

根據(jù)Job法繪制Job曲線（如圖2所示），從曲線的最高點(diǎn)可以判斷包合物的化學(xué)計(jì)量比。如果曲線的最高點(diǎn)為0.5，說明得到的包合物化學(xué)計(jì)量比為1∶1；如果最高點(diǎn)為0.67或0.75，則相對(duì)應(yīng)的化學(xué)計(jì)量比為1∶2或1∶3。因此，從圖3可以得出COR/HPβCD包合物的包合比為1∶1。

3.2 紫外可見光譜滴定

按照2.6節(jié)的方法，在200～800 nm下掃描紫外可見吸收光譜，得到COR/HPβCD包合物的紫外可見光譜滴定圖（圖3）。所有實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次。

3.3 一維和二維核磁共振氫譜（1H NMR和2D NMR）

從圖4可見，COR氫質(zhì)子的化學(xué)位移δ在1.8～2.5 ppm、 4.2～4.5 ppm和5.5～8.5 ppm，可與環(huán)糊精的氫質(zhì)子（δ 3.1～4.0和4.6～5.2）明顯區(qū)分開來。通過計(jì)算COR的這些質(zhì)子積分面積與HPβCD的H1積分面積，同樣可以得到COR與HPβCD包合物的包合比為1∶1。圖4 HPβCD（A）和COR/HPβCD包合物（B）在25℃下的1H NMR譜圖（D2O，氘代水峰用星號(hào)標(biāo)注）

3.4 熱分析

由圖7可見，COR（圖7A）在228.5℃有一個(gè)尖銳的吸熱峰，這是COR融化時(shí)的吸熱峰，之后在278.0℃又出現(xiàn)一個(gè)吸熱峰，該峰可能是COR的受熱分解峰。HPβCD（圖7B）在67.0℃處有一個(gè)非常寬大的吸熱峰，這是HPβCD的脫水吸熱過程。而從COR/HPβCD包合物的差熱圖（圖7C）可發(fā)現(xiàn)2285℃和278.0℃這兩個(gè)吸熱峰消失了，說明作為自由態(tài)的COR已經(jīng)不存在，同時(shí)HPβCD自身的寬大脫水吸熱峰也變小了，這可能是因?yàn)镃OR進(jìn)入HPβCD的空腔后，影響了水與HPβCD的結(jié)合。這也說明COR與HPβCD形成包合物后，熱力學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變。

3.5 XRD 粉末衍射

從圖9可見，COR（圖9A）呈晶型結(jié)構(gòu)，HPβCD（圖9B）呈無定形結(jié)構(gòu)。而COR/HPβCD包合物（圖9C）由部分晶型結(jié)構(gòu)和無定形結(jié)構(gòu)組成，但其晶型峰（2θ： 50～ 150）的位置較COR（圖9A）的晶型峰發(fā)生向左偏移，峰的強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；同時(shí)其無定形結(jié)構(gòu)部分（2θ： 150～ 350）與HPβCD（圖9B）也有明顯區(qū)別，這就說明形成的包合物具有新結(jié)構(gòu)。

3.6 紅外吸收光譜（FTIR）分析

由圖10可見，COR/HPβCD包合物（圖10C）的譜圖中有一些很小的特征峰與 COR（圖10A）和HPβCD（圖10B）有細(xì)微區(qū)別，在2920、1680、1610和1200～1500 cm

3.7 掃描電子顯微鏡分析（SEM）

掃描電子顯微鏡常被用于物質(zhì)表面結(jié)構(gòu)的定性分析，從圖11可見，COR呈棒狀晶體（圖11A），HPβCD是有空腔結(jié)構(gòu)的球狀晶體（圖11B），COR/HPβCD的物理混合物有棒狀和球狀兩種晶體結(jié)構(gòu)存在，只是兩種物質(zhì)的相互混合（圖11C）；而COR/HPβCD包合物則呈現(xiàn)出不規(guī)則的塊狀晶體，其形狀結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化（圖11D）。說明COR和HPβCD形成包合物后，表面晶形結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

3.8 COR/HPβCD包合物水溶性分析

據(jù)文獻(xiàn)[3，9～11]，COR的溶解度僅為4.3 mg/mL，按照2.5節(jié)的方法測(cè)定COR/HPβCD包合物的水溶性，經(jīng)過計(jì)算得到其溶解度為170.5 mg/mL，表明COR與HPβCD形成包合物后，水溶性得到顯著提高。

3.9 穩(wěn)定性分析

為進(jìn)一步對(duì)COR/HPβCD包合物的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，以證明HPβCD作為COR載體的負(fù)載能力。按照2.7節(jié)的方法，在模擬人體的胃液環(huán)境（pH=1.5）下，測(cè)定了COR/HPβCD包合物的分解情況。從圖12可見，COR溶液的紫外吸收值隨著時(shí)間的增加而逐漸減弱，這表明在一定程度下COR會(huì)慢慢分解。而相比COR/HPβCD包合物來看，其在相同條件下吸光度變化較小，

這表明COR與HPβCD形成包合后，其穩(wěn)定性得到提高。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了蟲草素（COR）與羥丙基β環(huán)糊精（HPβCD）之間形成的配位包合物的包合行為、包合物的制備及其結(jié)構(gòu)表征，并測(cè)定了蟲草素形成包合物后的水溶性和穩(wěn)定性。研究表明， COR與HPβCD形成包合物的包合比為1∶1， HPβCD能顯著地增加COR的水溶性和穩(wěn)定性。COR形成包合物后，其溶解度從4.3 mg/mL提高到170.5 mg/mL，提高了39.6倍， 分解溫度從200.0℃提高到261.0℃。這表明作為一種藥物載體，HPβCD對(duì)改善COR的水溶性和穩(wěn)定性起到了很大作用。此包合物制備方法簡(jiǎn)便易得、綠色環(huán)保，為蟲草素在醫(yī)藥產(chǎn)品的設(shè)計(jì)上提供了較好的思路。endprint