雙氫青蒿素單獨和聯(lián)合甲氨蝶呤在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系的抗腫瘤作用

張芊，王藝萌，姜蔚蔚，谷曉廣，張春雷

（北京大學(xué)第三醫(yī)院，北京100191）

皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（Cutaneous T cell lymphoma，CTCL）是一種原發(fā)于皮膚的非霍奇金淋巴瘤，其特征性表現(xiàn)是惡性單克隆性T淋巴細(xì)胞在皮膚的浸潤[1]。CTCL約占所有原發(fā)于皮膚淋巴瘤的75%～80%。大約2/3的CTCL是蕈樣肉芽腫（Mycosis fungoides，MF） 或 Sézary 綜合征（Sézary syndrome，SS），以MF最為常見[1]。目前CTCL治療手段包括局部和系統(tǒng)性治療，比如光療、甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）等，但尚無治愈的方法，仍需要探索新型的療效好、作用持久、不良反應(yīng)少的治療方法。青蒿素是從菊科植物黃花蒿（Artemisia annua L.）提取的，我國屠呦呦教授發(fā)現(xiàn)的抗瘧疾藥物，她因此獲得了2015年諾貝爾生理學(xué)獎。雙氫青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素最重要的活性衍生物，最初用于抗瘧疾治療，不良反應(yīng)小，后來研究證實其對多種腫瘤具有治療作用，可能通過氧化應(yīng)激反應(yīng)、DNA損傷和修復(fù)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式選擇性地抑制腫瘤細(xì)胞[2-4]。MTX是具有細(xì)胞毒性的葉酸拮抗劑，常用于CTCL治療[5]。本研究將通過觀察DHA和MTX對CTCL細(xì)胞系HH細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，探討DHA聯(lián)合MTX治療CTCL的分子機制。

1 資料與方法

1.1 主要資料及試劑 HH細(xì)胞系（ATCC號CRL-2105），RPMI1640 培養(yǎng)基（美國 Gibco?公司，貨號22400-089），胎牛血清（美國Gibco?公司，10099-141），DHA（美國 Sigma-Aldrich?公司，批號 D7439），MTX（美國輝瑞?公司，批號R46884），MTS細(xì)胞增殖檢測試劑盒（美國Promega?公司，G3580），F(xiàn)ITCAnnexin V凋亡檢測試劑盒（美國CA?公司），7-AAD試劑盒（美國BD?公司，559925），兔抗人Noxa單克隆抗體（美國Abcam?公司），兔抗人Caspase 3單克隆抗體、兔抗人Bax單克隆抗體、兔抗人p53單克隆抗體、兔抗人γ-H2AX單克隆抗體、兔抗人ATM單克隆抗體、鼠抗人β-Actin單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology?公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo?公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HH細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，取不同濃度的對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 MTS法測定細(xì)胞的存活率 取對數(shù)期HH細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)以2×104/mL的濃度在6孔板中接種2 mL，通過倍比稀釋分別在實驗組加入2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L DHA，5.0 μmol/L MTX，5.0 μmol/L DHA聯(lián)合5.0 μmol/L MTX（聯(lián)合組），對照組加入二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）后孵育箱培養(yǎng)。在 24、48、72 h 時混勻細(xì)胞，從各組取 100 μL 細(xì)胞混懸液至96孔板，每個濃度做3個復(fù)孔，每孔加入20 μL預(yù)先配置的MTS溶液，在37℃孵箱中孵育2 h，用分光光度儀測定490 nm處吸光值（A值），重復(fù)測定3次。與對照組比較，計算細(xì)胞活力，細(xì)胞增殖百分比＝[（A值處理組－A值培養(yǎng)基）/（A值對照組－A 值培養(yǎng)基）] × 100%。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期 取對數(shù)生長期的HH細(xì)胞以2×104/mL接種于6孔板，每孔3 mL，通過倍比稀釋分別在實驗組加入2.5、5.0、10 μmol/L DHA，5.0 μmol/L MTX，5.0 μmol/L DHA聯(lián)合5.0 μmol/L MTX（聯(lián)合組），對照組加入DMSO，每孔 1 μL，培養(yǎng) 24 h 或 48 h。

細(xì)胞周期的檢測：每組收集計數(shù)2×105個細(xì)胞，離心后在0.3 mL PBS緩沖液中重懸，向細(xì)胞中逐滴加入0.7 mL冰無水乙醇固定細(xì)胞，加入時不斷震蕩，置于-20℃下18 h。細(xì)胞懸液200轉(zhuǎn)/min離心5 min去除固定液，冰PBS緩沖液洗滌2次，沉淀用300μL PBS緩沖液重懸，加入10 μL 7-AAD溶液，避光室溫染色15 min，過濾后用流式細(xì)胞儀PE/7-AAD通道分析，計算G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞所占比例。重復(fù)測定3次，取平均值。

細(xì)胞凋亡的檢測：每組收集計數(shù)105個細(xì)胞，以冷PBS緩沖液洗滌2次，用細(xì)胞結(jié)合緩沖液以106個/mL的濃度重懸細(xì)胞，每管100 μL的細(xì)胞懸液加入FITC偶聯(lián)的Annexin V溶液5 μL和7-AAD溶液5 μL，混勻后避光染色15 min。每管加入300 μL結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測，采用FlowJo V10軟件分析，計算FITC陽性細(xì)胞百分比。重復(fù)測定3次，取平均值。

1.5 Western印跡法檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá) 取 5.0 μmol/L DHA組、5.0 μmol/L MTX 組、5.0 μmol/L DHA 聯(lián)合 5.0 μmol/L MTX 組（聯(lián)合組）及對照組培養(yǎng)48 h的HH細(xì)胞106個，離心棄上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入蛋白裂解液置于冰上，每隔5 min漩渦振蕩儀混勻3次，4℃18 000轉(zhuǎn)/min離心10 min。收集上清液，用BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒對待測蛋白進(jìn)行蛋白定量。將蛋白電泳上樣緩沖液加入到總蛋白溶液中，充分混勻，水浴鍋100℃煮沸變性5 min。在SDS-PAGE凝膠每孔分別加入30 μg總蛋白或2 μL預(yù)染色蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志，開始電泳時90V恒壓20～30min，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后增加至130 V恒壓40～60 min，電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部。300 mA 90 min將電泳條帶電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗，1∶800稀釋兔抗人Caspase 3單克隆抗體、1∶800 稀釋兔抗人 Bax單克隆抗體、1∶1 000 稀釋兔抗人Noxa單克隆抗體、1∶1 000稀釋兔抗人p53單克隆抗體、1∶1 000稀釋兔抗人ATM單克隆抗體、1∶1 000稀釋兔抗人γ-H2AX單克隆抗體、1∶1 000稀釋鼠抗人β-Actin單克隆抗體，4℃過夜。封閉洗滌緩沖液（TBST）洗滌3次，加入IRDyeTM 800CW染料標(biāo)記的山羊抗兔二抗、或山羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，雙紅外激光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行熒光顯色，分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件，計量資料以±s表示，增殖實驗數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。流式細(xì)胞凋亡實驗數(shù)據(jù)通過兩因素方差分析探討時間和濃度對凋亡比例的影響。若時間和濃度的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義，采用SPSS中一般線性模型模塊的UNIANOVA和EMMEANS子句實現(xiàn)單獨效應(yīng)分析[6]。即固定時間，比較不同濃度對凋亡比例的影響；固定濃度，比較不同時間對凋亡比例的影響。組間比較采用LSD檢驗進(jìn)行兩兩比較。雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHA和MTX對HH細(xì)胞體外增殖的影響 與對照組相比，2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L DHA 組、5.0 μmol/L MTX組、聯(lián)合組細(xì)胞增殖百分比有不同程度降低。重復(fù)測量方差分析顯示，DHA組間細(xì)胞增殖百分比隨時間變化存在趨勢（F＝716.967，P＜0.001，見圖1A），且各組間細(xì)胞增殖抑制百分比隨著 DHA 濃度增加也存在趨勢（F＝17.622，P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1A。5.0 μmol/L DHA組、5.0 μmol/L MTX組和聯(lián)合組細(xì)胞增殖百分比抑制隨時間變化存在趨勢（F＝1236.930，P＜0.001），見圖1B，聯(lián)合組抑制作用最明顯。各組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較，LSD檢驗顯示，24、48、72 h各組間細(xì)胞增殖百分比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。24、48、72 h聯(lián)合組細(xì)胞增殖百分比低于5.0 μmol/L DHA組和5.0 μmol/L MTX 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，DHA在體外能顯著抑制HH細(xì)胞增殖，且DHA聯(lián)合MTX對HH細(xì)胞增殖的抑制作用明顯強于這兩者單獨應(yīng)用。

2.2 DHA和MTX對HH細(xì)胞周期的影響 HH細(xì)胞經(jīng)過不同濃度 DHA（2.5、5.0、10.0 μmol/L）、DMSO或甲氨蝶呤處理48 h后，G0/G1期、G2/M期細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝8.015，P＜0.05；F＝32.245，P＜0.001）；S期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.526，P＝0.258），見表1。與對照組相比，各濃度DHA組、MTX組和聯(lián)合組G0/G1期細(xì)胞比例明顯上升、G2/M期細(xì)胞比例明顯下降（P＜0.05）。但不同濃度DHA組間細(xì)胞周期兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。聯(lián)合組與單獨應(yīng)用DHA組（5.0 μmol/L）或MTX（5.0 μmol/L）組分別比較細(xì)胞周期，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 DHA作用HH細(xì)胞48 h后對細(xì)胞周期的影響 （%，±s）

表1 DHA作用HH細(xì)胞48 h后對細(xì)胞周期的影響 （%，±s）

組別 G0/G1期 S期 G2/M期2.5 μmol/L DHA 60.50± 4.58 38.02± 4.90 1.48±1.01 5.0 μmol/L DHA 59.64± 9.83 39.34±10.43 1.03±1.34 10.0 μmol/L DHA 54.12± 8.84 44.79± 9.55 1.09±1.94 5.0 μmol/L MTX 61.68± 4.97 38.32± 4.97 0.00±0.00聯(lián)合組 65.98±12.47 34.02±12.47 0.00±0.00對照組 35.76± 8.32 50.56±10.96 13.88±3.65 F 8.015 1.526 32.245 P＜0.05 0.258 ＜0.001

2.3 DHA和MTX對HH細(xì)胞凋亡的影響 2.5、5.0、10.0 μmol/L DHA 組，5.0 μmol/L MTX 組，聯(lián)合組和對照組HH細(xì)胞經(jīng)過24 h或48 h處理后，時間和濃度的交互作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），凋亡細(xì)胞比例呈濃度依賴并隨時間延長而升高，聯(lián)合用藥效果強于單藥。隨著處理時間延長，藥物組細(xì)胞凋亡百分比增加（P<0.05）。藥物組處理HH細(xì)胞24 h 后，隨著 DHA 濃度升高（2.5、5.0、10.0 μmol/L），HH細(xì)胞凋亡百分比從11.96%（2.5 μmol/L DHA）增加到22.35%（10.0 μmol/L DHA），凋亡細(xì)胞百分比呈濃度依賴，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.866，P<0.05）；見圖2，處理48 h后，上述凋亡百分比從21.89%增加到42.70%，也存在濃度依賴（F=50.506，P＜0.001）。單獨應(yīng)用5.0 μmol/L DHA 或5.0 μmol/L MTX 處理HH細(xì)胞24 h，凋亡細(xì)胞百分比分別為15.86%和15.56%，而兩者聯(lián)合時凋亡百分比增加至21.14%，各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.513，P<0.05）；當(dāng)處理48 h后，單獨應(yīng)用DHA或MTX凋亡細(xì)胞百分比為31.60%和30.53%，而聯(lián)合組為46.76%，各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=41.713，P<0.001）。處理24 h或48 h后DHA各濃度組細(xì)胞凋亡百分比進(jìn)行兩兩比較，除 24 h 2.5 μmol/L 和 5.0 μmol/L DHA 組以外，其余各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。處理48 h后，聯(lián)合組分別與單藥DHA或MTX組兩兩比較，聯(lián)合組凋亡細(xì)胞比例均高于兩單藥組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但24 h時上述差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測DHA和MTX對HH細(xì)胞凋亡的影響

2.4 DHA和MTX對HH細(xì)胞凋亡和DNA損傷相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，各實驗組γ-H2AX、ATM、p53、Bax、Noxa、Caspase 3 活化片段蛋白條帶灰度增強，內(nèi)參對照是β-Actin。和單藥組相比，聯(lián)合用藥組 γ-H2AX、ATM、p53、Bax、Noxa、Caspase 3活化片段的蛋白表達(dá)明顯增加，而且聯(lián)合組增加程度強于單藥組，見圖3。

3 討論

CTCL是一種原發(fā)于皮膚的惡性淋巴瘤，探索具有良好應(yīng)用前景的CTCL治療方式至關(guān)重要的是發(fā)現(xiàn)新型有效、不良反應(yīng)少的藥物。如前所述，青蒿素是一種含有內(nèi)過氧化基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯化合物，屠呦呦教授闡明青蒿素對抗瘧原蟲感染有效。瘧疾治療全球標(biāo)準(zhǔn)是含青蒿素與其衍生物的聯(lián)合療法，幫助挽救了數(shù)百萬人的生命。DHA是青蒿素活性代謝產(chǎn)物，不良反應(yīng)少，耐受性好，臨床應(yīng)用廣泛。近年來很多研究顯示DHA對不同來源的腫瘤具有很強的治療作用[2-4]。但是很少有研究探討DHA對于CTCL的作用，而且DHA抗腫瘤的具體機制仍未被發(fā)現(xiàn)。針對這個問題，本研究首次發(fā)現(xiàn)DHA對CTCL細(xì)胞系HH細(xì)胞具有抗腫瘤作用。DHA作用CTCL細(xì)胞后，細(xì)胞增殖明顯下降，并呈濃度依賴和時間依賴。CTCL細(xì)胞增殖受抑制，可能是腫瘤細(xì)胞停止生長（細(xì)胞周期阻滯）或死亡。筆者觀察發(fā)現(xiàn)DHA作用CTCL細(xì)胞后，凋亡細(xì)胞比例增加，凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3活化片段表達(dá)上升，并且當(dāng)DHA與MTX聯(lián)合時作用增強。雖然DHA能使CTCL細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例上升、G2/M期下降，但不存在濃度依賴；并且S期細(xì)胞比例下降差異無統(tǒng)計學(xué)意義。DHA對CTCL的抗腫瘤作用可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生，聯(lián)合應(yīng)用MTX能增強上述效果。

圖3DHA和MTX對HH細(xì)胞凋亡和DNA損傷相關(guān)蛋白的影響

目前認(rèn)為DHA治療腫瘤的作用機制可能是：DHA的內(nèi)過氧化基團(tuán)裂解，隨后產(chǎn)生以碳為中心的自由基，激活后使細(xì)胞蛋白質(zhì)烷基化，還能產(chǎn)生ROS（Reactive oxygen species）等超氧化物[7]；氧化應(yīng)激、DNA損傷以及蛋白質(zhì)烷基化使細(xì)胞正常功能不能維持，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯或死亡[2,8]。除此之外，DHA還能抑制血管生成[9]以及阻止腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲[3,10]。青蒿素及其衍生物作用于60種腫瘤細(xì)胞系后，研究發(fā)現(xiàn)某些DNA損傷應(yīng)答和修復(fù)基因mRNA表達(dá)與其lgIC50值相關(guān)[11]，研究者推測這可能是因為青蒿素及其衍生物造成了DNA損傷，后有研究證實青蒿琥酯（青蒿素的一種活性衍生物）能夠劑量依賴性誘導(dǎo)DNA斷裂[12]。γ-H2AX是一種DNA相關(guān)組蛋白，DNA雙鏈斷裂（Double stranded breaks,DSBs）誘導(dǎo)其表達(dá)，是 DSBs的標(biāo)志[13]。DSBs發(fā)生后細(xì)胞啟動DNA損傷應(yīng)答，主要通過激活DNA依賴性蛋白激酶和ATM（Ataxia telangiectasia-mutated）等[14]。ATM激活后啟動DNA修復(fù)，如果修復(fù)失敗，沒能切除的DSBs使ATM直接或間接地活化p53，增強p53下游促凋亡基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15-16]。p53轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的促凋亡基因包括FasR、Bax、Puma、Noxa、Apaf-1和PIDD，都是DNA損傷應(yīng)答下游編碼蛋白[16]。促凋亡蛋白Bax和僅含BH3區(qū)域蛋白（BH3-only proteins）Noxa均屬Bcl-2家族，參與調(diào)控線粒體凋亡通路，繼而激活Caspase 9，級聯(lián)反應(yīng)激活Caspase 3，執(zhí)行細(xì)胞凋亡[17-18]。在本研究中，DHA、MTX或兩者聯(lián)合作用于HH細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受抑制，細(xì)胞凋亡比例上升，DSBs標(biāo)志γ-H2AX、DNA修復(fù)相關(guān)基因ATM、p53及下游促凋亡基因Bax、Noxa、Caspase 3活化片段蛋白量增加，提示DHA和MTX作用HH細(xì)胞系后，可能通過DNA損傷、誘導(dǎo)凋亡來抑制細(xì)胞增殖。

MTX是一種葉酸拮抗劑、還能抑制DNA甲基化，可用于多種CTCL治療，比如MF、SS、原發(fā)皮膚CD30陽性淋巴增殖性疾病和間變性大細(xì)胞淋巴瘤，特別是進(jìn)展期MF、SS和大細(xì)胞變MF[19-20]。當(dāng)葉酸拮抗劑與其他治療方法結(jié)合使用時，能產(chǎn)生協(xié)同效果，Bozic等[21]分析計算出聯(lián)合治療要優(yōu)于單藥治療。對于MF或SS患者，MTX低劑量單藥應(yīng)用有效率在33%，與貝沙羅汀聯(lián)合有效率在66%，與干擾素α聯(lián)用有效率在74%[22]。在本研究中，與單用DHA相比，DHA聯(lián)合MTX對HH細(xì)胞有更明顯的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)作用，并且凋亡相關(guān)基因p53、Noxa、Bax、Caspase 3 和 DNA 損傷相關(guān)基因 γ-H2AX、ATM蛋白的表達(dá)增加也強于DHA或MTX單藥，提示DHA聯(lián)合MTX能明顯提高對CTCL細(xì)胞系HH細(xì)胞的生長抑制。

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