白藜蘆醇對過氧化氫誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

楊影 吳崢崢 程依璉 林偉 曲超

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院眼科（成都610072）

年齡相關(guān)性黃斑變性（age?related macular de?generation，AMD）是50歲以上人群中視力損傷的主要原因之一。越來越多的證據(jù)表明視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinal pigment epithelium，RPE）的氧化損傷與AMD的發(fā)生有密切的聯(lián)系［1?4］。目前藥物治療AMD的研究主要為抗氧化劑的研究如葉黃素、維生素E和胡蘿卜素等和活血化瘀類中成藥，但效果不確切，因此研究一種預(yù)防和治療AMD的藥物勢在必行。白藜蘆醇是一類主要存在于虎杖、藜蘆、葡萄、花生等植物中的非黃酮類多酚化合物，屬于植物在抵抗外界刺激而產(chǎn)生的一種植物保護(hù)素［5?6］，藥理學(xué)研究表明它具有強(qiáng)大的抗氧化、清除氧自由基以及抗凋亡的能力［7］，但有關(guān)白藜蘆醇對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞是否具有抗氧化及抗凋亡活性以及它的作用機(jī)制，至今未見報(bào)道。本研究采用H2O2對人RPE細(xì)胞進(jìn)行氧化損傷，給予白藜蘆醇預(yù)處理，研究白藜蘆醇對人RPE細(xì)胞凋亡有無抑制作用，并探討可能的作用機(jī)制，從而為老年性黃斑變性的防治尋找新的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器 白藜蘆醇和H2O2溶液（購自美國 Sigma Aldrich公司），RPMI?1640培養(yǎng)基、胎牛血清（購自美國GIBCO公司）、CCK?8試劑盒（購自美國Sigma公司），超凈工作臺(tái)（購自蘇州凈化設(shè)備有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（購自美國Shellab公司），Annexin?V凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；碘化丙啶購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 遵守快融的原則，將細(xì)胞凍存管從液氮罐中取出，置于55～65℃水浴中迅速解凍，取出細(xì)胞懸液，注入離心管并加入5 mL的含10%胎牛血清（FBS）的細(xì)胞培養(yǎng)液。以800～1 000 r/min離心5 min，除去上清液，加入1 mL培養(yǎng)液吹打，使其形成懸浮液。用含20%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，調(diào)整細(xì)胞濃度為50×106mL接種到25 cm2培養(yǎng)瓶，置于37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每2天換液1次，細(xì)胞近鋪滿（80%～90%）時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期的人RPE傳代細(xì)胞接種于6孔板及96孔板中。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 選取生長良好的第3～5代人RPE傳代細(xì)胞采用無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，同步化后分成3組：第一組為正常對照組，每組3孔，用6 mL DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞；第二組為氧化損傷組，用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后將200 μmol/L H2O2加入RPE細(xì)胞培養(yǎng)液中制備RPE細(xì)胞氧化損傷模型。第三組為白藜蘆醇保護(hù)組，將50 mg/L白藜蘆醇加入RPE細(xì)胞培養(yǎng)液中，24 h后加入 200 μmol/L H2O2，將細(xì)胞置于 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)2、8、24 h。

1.2.3 CCK?8法檢測細(xì)胞活性 取其第3代，0.25%胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，按每孔0.2 mL接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，無血清培養(yǎng)液洗滌3次，按上述分組方案進(jìn)行分組加藥，將細(xì)胞置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)2、8、24 h后，棄去接種液，加入CCK?8 10 μL，37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后棄液，加入DMSO 100 μL，振蕩10～15 min，用酶標(biāo)儀測光密度A值。計(jì)算不同濃度藥物作用后對細(xì)胞的抑制率。細(xì)胞增生抑制率（HA）=（對照組A值?實(shí)驗(yàn)組A值）/對照組A值×100%。

1.2.4 細(xì)胞周期的檢測 收集生長良好的人RPE細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106mL，分別接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，按照實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后，將細(xì)胞置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)2、8、24 h，加入冰浴預(yù)冷70%乙醇中固定過夜。棄去乙醇，PBS清洗2次，加入0.5 mL碘化丙啶染色液，37℃避光溫浴30 min。采用流式細(xì)胞儀檢測樣品，采用Multicycle分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 取對數(shù)生長期的人RPE傳代細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后，按照實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后，加入適量胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞，取5萬～10萬重懸的細(xì)胞，1 000g離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V?FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。室溫（20～25℃）避光孵育10 min。1 000g離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V?FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析和Turkey′s多因素t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對人RPE細(xì)胞抑制率的影響 通過CCK?8法檢測發(fā)現(xiàn)，50 mg/L白藜蘆醇保護(hù)組作用2、8、24 h細(xì)胞抑制率分別為 17.01%、19.97%、24.58%，明顯降低了細(xì)胞抑制率，且與氧化損傷組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 白藜蘆醇對人RPE細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，氧化損傷組細(xì)胞凋亡率顯著增高（P＜0.01），經(jīng)白藜蘆醇保護(hù)作用2、8、24 h后，與氧化損傷組相比細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 白藜蘆醇對人RPE細(xì)胞凋亡的影響Tab.1 The effect of resveratrol on apoptosis of human RPE cells ±s，%

表1 白藜蘆醇對人RPE細(xì)胞凋亡的影響Tab.1 The effect of resveratrol on apoptosis of human RPE cells ±s，%

注：白藜蘆醇保護(hù)組和氧化損傷組比較，★P＜0.01；氧化損傷組和對照組比較，△P＜0.01

2 h 8 h 24 h組別正常對照組氧化損傷組白藜蘆醇保護(hù)組正常對照組氧化損傷組白藜蘆醇保護(hù)組正常對照組氧化損傷組白藜蘆醇保護(hù)組凋亡率7.45±0.41 14.24±0.29△9.29±0.03★6.99±0.07 19.28±0.15△10.12±0.09★7.47±0.09 25.60±1.06△18.22±0.69★

2.3 白藜蘆醇對人RPE細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，氧化損傷組G0/G1期、G2/M期細(xì)胞比例顯著增加，S期細(xì)胞比例顯著減少（P＜0.01）；經(jīng)白藜蘆醇保護(hù)作用2、8、24 h后，處于G0/G1期細(xì)胞比例和氧化損傷組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；處于S期細(xì)胞比例和氧化損傷組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。圖1、表2。

圖1 白藜蘆醇作用人RPE細(xì)胞2、8、24 h后對細(xì)胞周期的影響Fig.1 The effect of RPE cells on the cycle of human RPE cells at 2、8、24 h

表2 白藜蘆醇對人RPE細(xì)胞周期的影響Tab.2 The effect of resveratrol on cycle of human RPE cells ±s，%

表2 白藜蘆醇對人RPE細(xì)胞周期的影響Tab.2 The effect of resveratrol on cycle of human RPE cells ±s，%

注：白藜蘆醇保護(hù)組和氧化損傷組比較，*P＜0.01；氧化損傷組和對照組比較，△P＜0.01

G2/M 3.2±0.09 18.21±0.13△42.14±0.65*2.04±0.72 32.75±0.79△17.21±0.46*7.58±0.07 51.10±0.47△40.54±0.24*組別正常對照組氧化損傷組白藜蘆醇保護(hù)組正常對照組氧化損傷組白藜蘆醇保護(hù)組正常對照組氧化損傷組白藜蘆醇保護(hù)組G0/G1 40.22±0.20 55.13±0.08△14.67±0.88*44.91±0.37 48.21±0.45△40.85±0.25*44.23±0.10 47.18±0.35△25.75±0.31*S 2 h 8 h 24 h 56.57±0.12 26.64± 0.22△43.02±0.40*53.05±0.34 19.03± 0.38△41.94±0.23*48.18±0.02 18.70± 0.18△33.71±0.10*

3 討論

AMD的病因?qū)W和發(fā)病機(jī)制至今未明，目前多數(shù)研究認(rèn)為與老化、氧化損傷、炎癥免疫、血管生成及抑制因子失調(diào)等因素有關(guān)［8］，隨著年齡增長，人體抗氧化能力逐漸減弱，RPE細(xì)胞位于脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層和光感受器細(xì)胞層之間，導(dǎo)致其特別容易受到氧自由基的攻擊，從而引起AMD等視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生［9］，已有研究證實(shí)，RPE細(xì)胞的氧化損傷在AMD的早期即可出現(xiàn)［10?11］。氧化損傷往往伴隨凋亡的發(fā)生［12］，研究發(fā)現(xiàn)［13］，RPE氧化損傷的主要靶細(xì)胞器是線粒體，其損傷水平取決于活性氧的量?；钚匝醯尼尫趴梢酝ㄟ^誘導(dǎo)REP細(xì)胞的凋亡，參與視網(wǎng)膜色素上皮屏障功能的損傷。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)［14］，氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)REP細(xì)胞發(fā)生凋亡，這可能是AMD早期RPE細(xì)胞死亡的一個(gè)途徑。H2O2是一種極易透過細(xì)胞膜的強(qiáng)氧化劑，通過增加細(xì)胞內(nèi)活性氧含量發(fā)揮對細(xì)胞的氧化損傷作用［15?17］。自從20世紀(jì) 40 年代以來，白藜蘆醇一直頗受醫(yī)學(xué)界的重視，尤其是其抗氧化與自由基能力尤為突出，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能清除多種活性氧簇［18］，但未見報(bào)道對RPE細(xì)胞保護(hù)作用的研究，本實(shí)驗(yàn)以活性氧形式之一的H2O2作用于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，造成RPE氧化損傷，研究白藜蘆醇對RPE凋亡的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2氧化損傷組2、8、24 h細(xì)胞抑制率為26.77%、37.81%、66.12%，白藜蘆醇保護(hù)組作用2、8、24 h細(xì)胞抑制率分別為17.01%、19.97%、24.58%，與氧化損傷組相比明顯降低了細(xì)胞抑制率，且與時(shí)間呈依賴性，表明白藜蘆醇對體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞氧化損傷有一定的保護(hù)作用，能顯著降低細(xì)胞抑制率。

研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可導(dǎo)致RPE細(xì)胞大量凋亡，而預(yù)先加入陽性對照藥白藜蘆醇培養(yǎng)，可明顯抑制RPE細(xì)胞凋亡，白藜蘆醇保護(hù)作用2、8、24 h后，與氧化損傷組相比細(xì)胞凋亡率明顯降低，說明白藜蘆醇保護(hù)氧化損傷的RPE細(xì)胞，降低細(xì)胞抑制率是通過抑制RPE細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)。

當(dāng)細(xì)胞的生長被阻滯在某個(gè)階段，細(xì)胞就會(huì)對損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)，如果修復(fù)失敗，則會(huì)發(fā)生凋亡，細(xì)胞的增殖必然受影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白藜蘆醇作用于RPE細(xì)胞后，處于G0/G1期細(xì)胞比例和氧化損傷組相比明顯降低，處于S期細(xì)胞比例明顯升高，表明白藜蘆醇在一定程度上可以促進(jìn)氧化損傷的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)展，由G0/G1期進(jìn)入S期，推測白藜蘆醇抑制RPE細(xì)胞凋亡可能是通過調(diào)控細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期。

綜上所述，白藜蘆醇對體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞氧化損傷有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過調(diào)控細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期，從而抑制RPE細(xì)胞凋亡，提示白藜蘆醇對AMD的預(yù)防和治療有一定的作用。鑒于體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞與活體內(nèi)的RPE有一定差別，對各種損傷的反應(yīng)也可能會(huì)有所不同，所以白藜蘆醇對于RPE的保護(hù)作用及其在臨床上的治療效果和具體應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

［1］ PROMSOTE W，VEERANAN?KARMEGAM R，ANANTH S，et al.L?2?oxothiazolidine?4?carboxylic acid attenuates oxidative stress and inflammation in retinal pigment epitheliuml［J］.Mol Vis，2014，20（1）：73?88.

［2］ KHANDHADIA S，LOTERY A.Oxidation and age?related macu?lar degeneration：insights from molecular biology［J］.Expert Rev Mol Med，2010，12（1）：34-36.

［3］ XIE W，YU W，ZHAO M，et al.Protective effect of paeoniflorin against oxidative stress in human retinal pigment epithelium in vitro［J］.Mol Vis，201l，17（15）：3512?3522.

［4］ GIANNIOU C，DIRANI A，F(xiàn)ERRINI W，et al.Two?year out?come of an observe?and?plan regimen for neovascular age?related macular degeneration：how to alleviate the clinical burden with maintained functional results［J］.Eye，2015，29（3）：450?451.

［5］ 張黎，李勇，周暢，等.白藜蘆醇對人胰腺癌細(xì)胞Capan?1增殖和細(xì)胞周期的影響［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（1）：14?16.

［6］ THANAN R，OIKAWA S，HIRAKU Y，et al．Oxidative stress and its significant roles in neurodegenerative diseases and cancer［J］.Int J Mol Sci，2015，16（1）：193?217.

［7］ KISELEV K V．Perspectives for production and application of res?veratrol［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2011，90（2）：417?425.

［8］ LETTNER A． Age?related macular degeneration?bioloIgy andtreatment［J］.Med Monatsschr Pharm，2015，38（7）：258?264.

［9］ HAN S Y，BAE J H，OH J，et al.Intravitreal ranibizumab for subfoveal choroidal neovascularization from age?related macular degeneration with combined severe diabetic retinopathy［J］.Dia?betes Metab J，2015，39（1）：46?50.

［10］ 李鐘睿，馮卓蕾，孫云端，等.葛根素對過氧化氫誘導(dǎo)ARPE一19細(xì)胞活力損傷和凋亡的影響［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，48（6）：476?479.

［11］ HAN S Y，BAE J H，OH J，et al.Intravitreal ranibizumab for subfoveal choroidal neovascularization from age?related macular degeneration with combined severe diabetic retinopathy［J］.Dia?betes Metab J，2015，39（1）：46?50.

［12］ BHULLAR K S，HUBBARD B P.Lifespan and heahhspan exten?sion by resveratrol［J］.Biochim Biophy Acta，2015，1852（6）：1209?l218.

［13］ ONG B B，AH?FAT F G.Age?related macular degeneration［J］.Br J Hosp Med（Lond），2016，77（2）：C18?21.

［14］ WONG W L，SU X，LI X，et al.Global prevalence of age?relat?ed macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040：a systematic review and meta?analysis［J］.Lancet G lob Health，2014，2（2）：106?116.

［15］ KAMAT C D，GADAL S，MHATRE M，et al.Antioxidants incen?tral nervous system diseases：preclinical promise and transla?tional challenges［J］.J Alzheimers Dis，2008，15（3）：473?493.

［16］ 賀芳，劉曉梅，何葉成，等.肝細(xì)胞生長因子對體外缺血/再灌注星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版，2014，35（3）：279?285.

［17］ 馮潔，裴保香.復(fù)方丹參滴丸對過氧化氫損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，27（2）：159?161.

［18］ SUBRAMANIAN L，YOUSSEF S，BHATTACHARYA S，et al.Resveratrol：challenges in translation to the clinic?a critical dis?cussion［J］.Clin Cancer Res，2010，16（24）：5942?5948.